微生物染色的基本原理，是借助物理因素和化學因素的作用而進行的。物理因素如細胞及細胞物質對染料的毛細現象、滲透、吸附作用等。化學因素則是根據細胞物質和染料的不同性質而發生地各種化學反應。酸性物質對于堿性染料較易吸附，且吸附作用穩固；同樣，堿性物質對酸性染料較易于吸附。如酸性物質細胞核對于堿性染料就有化學親和力，易于吸附。但是，要使酸性物質染上酸性材料，必須把它們的物理形式加以改變（如改變pH值），才利于吸附作用的發生。相反，堿性物質（如細胞質）通常僅能染上酸性染料，若把它們變為適宜的物理形式，也同樣能與堿性染料發生吸附作用。

常用染色法

單染色法

只用一種染料染色。由于大多數細菌胞漿內含有酸性物質，可與堿性染料結合，故常用呂氏美藍、結晶紫和稀釋石碳酸復紅等染液。此法可觀察細菌的大小、形態與排列，不能顯示細菌的結構與染色特性。

2.復染色法

用兩種或兩種以上不同染料可將細菌染成不同的顏色，除可觀察細菌的大小、形態與排列外，還反應出細菌染色特性，具有鑒別細菌種類的價值。常用的有革蘭染色法和抗酸染色法。

(1)革蘭染色：①細菌涂片經火焰固定，加結晶紫染液染1min，清水沖去染液。②加碘液媒染 1min，水洗，甩干。③用95%乙醇脫色，輕輕搖動約30s，至無紫色洗落為止，水洗，甩干。④加稀釋石碳酸復紅或沙黃染液數滴進行復染，約30s，水洗。⑤干后顯微鏡下鏡檢觀察結果，革蘭陽性菌染成紫色，革蘭陰性菌為紅色。

(2)抗酸染色：萋-尼 (Ziehl-Neelse)抗酸染色法：

①細菌涂片經火焰固定，加石炭酸復紅溶液，徐徐加熱至有蒸氣出現，切不可沸騰。染液因蒸發減少時，應隨時補充，防止染液蒸干。持續染5min(奴卡菌需要加長時間)，水洗，甩干。

②滴加3%鹽酸乙醇脫色，不時搖動玻片至無紅色脫落為止，水洗，甩干。

③加呂氏美藍復染液數滴復染1min，水洗。

④干后顯微鏡下鏡檢觀察結果，抗酸桿菌染成紅色，非抗酸桿菌為藍色。

金胺O-羅丹明B染色法：①細菌涂片固定后加第1液30——90s。②棄去第1液后加第2液染15min。③用第3液脫色1——2min，水洗。④滴加第4液染30s，水洗，

⑤干后置熒光顯微鏡下鏡檢觀察結果 在淡藍色背景下，抗酸桿菌呈紅色，其它細菌和細胞呈藍色。

3.特殊染色法

(1)鞭毛染色(改良Ryu法)：

①玻片的處理 將新載玻片浸泡在95%乙醇中。臨用時取出，以干凈紗布擦干。

②在玻片上滴蒸餾水1滴。

③挑取培養物少許，輕觸蒸餾水滴頂部，僅允許極少量細菌進入水滴，不可攪動，以免鞭毛脫落。④置35℃孵箱自然干燥，不能用火焰固定，滴加鞭毛染液染1——2 min輕輕水洗。

⑤干后顯微鏡鏡檢觀察結果 鞭毛和菌體呈紫色。

(2)異染顆粒染色(阿爾培托法)：

①細菌涂片經火焰固定，加甲液染色3——5min。水洗。

②滴加乙液，染1min。水洗。

③干后顯微鏡鏡檢觀察結果 菌體呈綠色，異染顆粒呈藍黑色,用于白喉棒狀桿菌染色。

(3)莢膜染色：

①奧爾特莢膜染色法：將已固定的細菌涂片滴加3%沙黃染液，用火焰加溫染色，持續3min，冷卻后水洗，待干鏡檢。結果：菌體呈褐色，莢膜呈黃色，此法主要用于碳疽芽胞桿菌。

②Hiss氏硫酸銅法：染液：第一液為結晶紫乙醇飽和液5ml加蒸餾水95ml 的混合液;第二液為20%硫酸銅水溶液。方法：細菌涂片自然干燥，乙醇固定。滴加第一液，微加熱染1min。再用第二液將涂片上的染液洗去，勿再水洗，傾去硫酸銅液，以吸水紙吸干鏡檢。結果：菌體及背景呈紫色，莢膜呈鮮藍色或不著色。

(4)芽胞染色：

染液：第一液為萋-納氏石炭酸復紅液，第二液為95%乙醇，第三液為堿性美藍液。

方法：將已固定的細菌涂片滴加第一液，微加熱染5min，冷卻后水洗。用第二液脫色2min，水洗。加第三液復染1min，水洗，待干鏡檢。結果：菌體呈藍色，芽胞呈紅色。

4.負染色法

背景著色而菌體本身不著色的染色為負染色法。最常見的是墨汁負染色法，用來觀察真菌及細菌莢膜等。在標本涂片處滴加染液，混合后加上蓋玻片(勿產生氣泡)，輕壓。在低倍鏡下尋找有莢膜的菌細胞，轉高倍鏡或油鏡確認，如新型隱球菌可見寬厚透亮的莢膜，背景為黑色。

5.熒光染色法

經熒光素染色的細菌，或熒光素標記的熒光抗體與相應抗原的細菌、病毒結合形成的復合物，在熒光顯微鏡下發出熒光。

細菌染色的一般程序

細菌染色的一般程序是：涂片(干燥)—固定—染色(媒染)—(脫色)—(復染)。

涂片制備

血液、分泌物、排泄物、穿刺液和液體培養物，直接在載玻片上作薄膜涂片;尸檢或感染動物組織，病變局部涂抹采樣的棉拭子直接涂片。固體培養基上的菌落或菌苔的制片，先用接種環取一環生理鹽水置載玻片中央，再用無菌接種環取少量的培養物在生理鹽水中磨勻，涂布成1cm2大小的涂面，置室溫下自然干燥或遠火慢慢烘干。

2.固定

目的是殺死細菌，凝固細菌蛋白及結構，便于染色;促使細菌粘附在載玻片上，避免在水洗過程中被水沖掉;改變細菌對染料的通透性，有利于菌細胞內結構的染色。通常用火焰加熱固定，將已干燥的涂片在火焰中迅速通過3次，以手背皮膚接觸玻片不燙為佳。

3.染色

根據檢驗目的不同，選擇不同的染色方法進行染色。染色時滴加染液，以復蓋標本為度。

4.媒染

凡能增強染料和被染物的親和力，使染料固定于被染物及能引起細胞膜通透性改變的物質，稱媒染劑。常用的有明礬、鞣酸、金屬鹽和碘等，也有用加熱法促進著色。媒染劑可用于初染與復染之間，也可用于固定之后或含于固定液、染色中。

5.脫色

凡能使已著色的被染物脫去顏色的化學試劑稱為脫色劑。常用乙醇、丙酮等作為脫色劑。脫色劑可以查出細菌與染料結合的穩定程度，作為鑒別染色之用。

6.復染

已脫色處理的細菌或其結構常以復染液作復染以便于觀察。復染液與初染液的顏色不同而成一鮮明對比。復染不宜太強，以免掩蓋初染的顏色。

主要用于厭養菌動力的檢查。通常選用60——70mm長。0.5——1.0mm孔徑的毛細管虹吸厭養菌懸液后，用火焰將毛細管兩端熔封。并用塑膠紙將毛細管固定在載玻片上，置高倍鏡下暗視野觀察。