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上海遠慕生物科技有限公司

質粒DNA的轉化實驗操作步驟
點擊次數:281 更新時間:2023-09-26

  實驗方法原理

  轉化活性是檢測質粒生物活性的重要指標,在基因克隆技術中,轉化(transformation)是特指以質粒 DNA 或以它為載體構建的重組質粒 DNA(包括人工染色體)導入細胞的過程, 是一種常用的基本實驗技術。 該過程的關鍵是受體細胞的遺傳學特性及其所處的生理狀態,用于轉化的受體細胞一般是限制修飾系統缺陷的變異株,以防止對導入的外源的切割,用 R- M- 符號表示。 此外,為了便于檢測,受體菌一般應具有可選擇的標記(例如抗生素敏感性、顏色變化等)。 但質粒 DNA 能否進入受體細胞則取決于該細胞是否處于感受態(competence)。所謂感受態是指受體細胞處于容易吸收外源 DNA 的一種生理狀態,可通過物理化學的方法誘導形成,也可自然形成(自然感受態)。 在基因工程技術中,通常是采用誘導的方法。 大腸桿菌是常用的受體菌,其感受態一般是通過用 CaCl2 在 0℃ 條件下處理細胞而形成,基本原理是: 細菌處于 0℃ 的 CaCl2 低滲溶液中,會膨脹成球形,細胞膜的通透性發生變化,轉化混合物中的質粒 DNA 形成抗 DNase 的羥基一鈣磷酸復合物粘附于細胞表面,經 42 ℃ 短時間熱激處理,促進細胞吸收 DNA 復合物,在豐富培養基上生長數小時后,球狀細胞復原并分裂增殖,在選擇培養基上便可獲得所需的轉化子。

  實驗材料 大腸桿菌PUC18 質粒

  試劑、試劑盒 LB 液體培養基含(和不含)氨芐靑霉素的 LB 平板LB 培養基CaCl2

  儀器、耗材 塑料離心管微量進樣器玻璃涂棒恒溫水浴鍋(37℃42℃)分光光度計臺式高速離心機

  實驗步驟

  1. 制備感受態細胞

  1.1 將大腸桿菌 HB101 在 LB 瓊脂平板上劃線,37℃ 培養 16~20 h。

  1.2 在劃線平板上挑一個單菌落于盛有 20 ml LB 培養基的 250 ml 三角瓶中,37℃ 振蕩培養到細胞的 OD600 值為 0.3~0.5 之間,使細胞處于對數生長期或對數生長前期。

  1.3 將培養物于冰溶中放置 10 min,然后轉移到 2 個 10 ml 預冷的無菌離心管中,4000 r/min,0℃~4℃ 亡離心 10 min。

  1.4 棄上清,倒置離心管 1 min, 流盡剩余液體后,置冰溶 10 min。

  1.5 分別向二管加入 5 ml 用冰預冷的 0.1 mol/L CaCl2 溶液懸浮細胞, 置冰浴中 20 min。 CaCl2 的純度至關重要,不同廠家,甚至同一廠家不同批號的產品,均影響感受態的形成。

  1.6 4000 r/min,0℃~4℃ 離心 10 min 回收菌體, 棄上清。分別向二管各加入 1 ml 冰冷的 0.1 mol/L CaCl2 溶液,重新懸浮細胞,

  1.7 按每份 200 ul 分裝細胞于無菌小塑料離心管中,如果不馬上用可加入終濃度為 10% 的無菌甘油,置 -20℃ 或 -70℃ 存備用。

  制得的感受態細胞,如果在 4 ℃ 放置 12~24 h, 其轉化率可增高 4~6 倍,但 24 h 后,轉化率將下降。

  以上均嚴格無菌操作。

  2. 轉化

  2.1 加 10 ul 含約 0.5 ug 自制的 pUC18 質粒 DNA 到上述制備的 200 ul 感受態細胞中。 同時設三組對照:不加質粒;不加受體;加已知具有轉化活性的質粒 DNA。具體操作參照下表進行。

  2.2 將每組樣品輕輕混勻后,冰浴 30~40 min, 然后置 42℃ 水浴熱激 3 min, 迅速放回冰浴 1~2 min。

  2.3 向每組樣品中加入等體積的 2×LB 培養基,置 37℃ 保溫 1~1.5 h, 讓細菌中的質粒表達抗生素抗性蛋白。

  2.4 每組各取 100 ul 混合物涂布于含氨芐青霉mei素(50 ug/ml)的選擇平板上,室溫下放置 20~30 min。

  2.5 待菌液被瓊脂吸收后,倒置平板于 37℃ 培養 12~16 h,觀察結果。

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