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質(zhì)粒提取試劑盒中各溶液配方及作用介紹
點(diǎn)擊次數(shù):256 更新時(shí)間:2023-09-19

提質(zhì)粒是分子生物學(xué)中基本,easy的實(shí)驗(yàn)。wan全不需要借助大腦,直接照著提取試劑盒中的操作說明傻瓜操作即可(其實(shí)應(yīng)該由機(jī)器人在實(shí)驗(yàn)室中操作這些簡單卻耗時(shí)的實(shí)驗(yàn))。盡管操作簡單,提質(zhì)粒卻也是一個(gè)比較重要的步驟,提出質(zhì)粒的質(zhì)量和數(shù)量將直接決定著后續(xù)實(shí)驗(yàn)室的成敗。當(dāng)我們按照試劑盒中操作說明進(jìn)行操作時(shí),我們會(huì)看到P1,P2,N3, PE,EB等不同的溶液(不同試劑盒可能標(biāo)識(shí)不同)。那么大家是否知道每瓶溶液中裝的什么?它們在質(zhì)粒提取過程中的作用又是怎樣的?


Omega試劑1.png


質(zhì)粒提取采用的是強(qiáng)堿裂解法(alkaline lysis),那么我們現(xiàn)在來看一下溶液 P1 , P2, N3, PE, EB都是什么。

溶液1(P1)

組分濃度 25 mM Tris-HCl(pH8.0),10 mM EDTA,50 mM 葡糖糖(Glucose)

溶液1的主要作用是將菌體沉淀懸浮起來。25mM Tris-HCl是緩沖溶液,保證反應(yīng)體系的pH恒定。EDTA是金屬離子螯合劑,10 mM EDTA的作用是與微生物體內(nèi)的金屬離子相互結(jié)合,抑制DNase的活性。50 mM葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,保證菌體懸浮,延緩菌體沉降的時(shí)間。溶液1在使用前通常要加入RNA酶(RNase A),RNA酶的作用很清楚,降解掉溶液中的RNA。由于RNA酶屬于蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)穩(wěn)定性很差,所以加了RNase A的溶液1需要低溫4oC保存。

溶液2(P2)

組份濃度 250 mM NaOH,1%(W/V)SDS(十二烷基硫酸鈉)

溶液2的主要作用是細(xì)胞裂解。溶液1將細(xì)胞懸浮后,就需要添加溶液2了,溶液2的作用就是對細(xì)胞進(jìn)行裂解。溶液2只包括兩種成分:氫氧化鈉和SDS。真正起到到細(xì)胞裂解作用的是氫氧化鈉,這也是為什么這個(gè)方法會(huì)被叫做堿裂解法。氫氧化鈉會(huì)破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu),使之發(fā)生bilayer(雙層膜)結(jié)構(gòu)向micelle(微囊)結(jié)構(gòu)的相變化,從而導(dǎo)致細(xì)胞的裂解。SDS的作用將在下一步提到。添加溶液2后需要注意的一個(gè)是時(shí)間一定不能過長,另一個(gè)是不可以劇烈震動(dòng)離心管。時(shí)間過長以及劇烈震動(dòng)都將導(dǎo)致氫氧化鈉破壞基因組DNA,斷裂的基因組DNA碎片將會(huì)與相似大小質(zhì)粒一同被抽提,污染樣品。

溶液3(N3)

組份濃度 3M cu酸鉀(potassium acetate),5M 醋酸

溶液3的主要作用是中和第二步加入的強(qiáng)堿以及清除掉蛋白質(zhì)等細(xì)胞內(nèi)的雜質(zhì)。N是neutralized的縮寫。強(qiáng)堿溶液氫氧化鈉長時(shí)間與DNA基礎(chǔ)會(huì)破壞其結(jié)構(gòu),因此需要進(jìn)行中和。中和氫氧化鈉,5 M醋酸就足夠了,為何又要加入cu酸鉀呢?做過質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)的同學(xué)應(yīng)該記得,在加入溶液N3后,會(huì)有大量沉淀出現(xiàn)。這些沉淀其實(shí)醋cu酸鉀與溶液2中的SDS相互作用,反應(yīng)生成的十二烷基硫酸鉀(potassium dodecylsulfate, PDS)。加入溶液N3后,SDS遇到鉀離子,生成PDS不溶于水,會(huì)迅速發(fā)生沉淀。

那么溶液3的加入是如何清除掉蛋白質(zhì),基因組DNA等雜質(zhì)的呢?道理是,溶液2中加入的十二烷基硫酸鈉(SDS)很容易與蛋白質(zhì)結(jié)合,平均兩個(gè)氨基酸就會(huì)結(jié)合一個(gè)SDS分子,二者結(jié)合會(huì)形成SDS2多肽復(fù)合體,這樣變性蛋白質(zhì)將溶解在溶液中,從而使得多肽鏈更好地與基因組DNA纏繞。加入溶液3后,由于十二烷基硫酸鹽與變性蛋白質(zhì)結(jié)合成復(fù)合體,十二烷基硫酸鉀的沉淀就將變性的蛋白質(zhì)一起沉淀,同時(shí)變性的蛋白質(zhì)與基因組DNA纏繞,結(jié)果也大部分被共沉淀了。而高離子濃度的溶液又加速了這一沉淀過程。此外,溶液被中和后變性蛋白質(zhì)表面電荷減少,也可以促進(jìn)變性蛋白質(zhì)沉淀。

溶液PE (wash buffer)

組分濃度10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 80 % 乙醇(Ethanol)

Wash buffer的作用主要是清洗掉多余的鹽離子。試劑盒中都是利用硅膠柱進(jìn)行DNA提取的。在DNA與硅膠柱吸附后,需要利用Wash buffer清洗掉多余的鹽離子。Wash buffer中含有高濃度的乙醇,由于乙醇會(huì)影響后續(xù)的酶切或測序反應(yīng),在洗脫DNA前必須要在離心機(jī)內(nèi)"空甩"柱子,wan全清除掉乙醇。

溶液EB(Elution buffer)

組分濃度10 mM Tris-HCl (pH 7.5)

EB的作用就是洗脫硅膠柱上的DNA樣品。Elution buffer中不能含有過高濃度的鹽離子,因?yàn)樵诟啕}環(huán)境中,鹽陽離子會(huì)打破硅膠負(fù)氧根和水之間的氫鍵,使得整體的硅膠攜帶正電,會(huì)吸引攜帶負(fù)電的DNA分子。另外,加熱過的洗脫液(<50°C)可以加速DNA從硅膠膜上脫離下來。另外,離心前保持EB緩沖液在膜上停留時(shí)間長一些,將更有利于DNA的洗脫。

不同公司的質(zhì)粒提取試劑盒中溶液成分可能有所差異,比如P1中可以去除掉葡萄糖,溶液PE甚至可以直接用水來代替等等。質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)是分子生物學(xué)中的基本且重要的實(shí)驗(yàn),盡管實(shí)驗(yàn)本身簡單,但其原理還是有些復(fù)雜的。只要清楚實(shí)驗(yàn)的原理,當(dāng)實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)問題之時(shí),會(huì)能夠更容易找到原因并給予糾正。


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