RNA抽提的竅門(mén)

1：快速阻止 Rnase 活性 – 樣品收集后快速冷凍，裂解時(shí)快速操作滅活 Rnase。

2：選擇合適的抽提方法 – 高核酶含量的組織，脂肪組織最好用含苯ben酚的方法。

3：預(yù)判質(zhì)量要求 – Northern，cDNA 文庫(kù)構(gòu)建對(duì)完整性要求高，RT-PCR, RPA (Ribonuclease protection assay) 對(duì)完整性要求不是很高。RT-PCR 對(duì)純度 (酶抑制物殘留) 要求很高。

4：徹di底勻漿是提高得率和降低降解的關(guān)鍵。

5：檢查 RNA 的完整性 – 電泳檢測(cè)，28S:18S =2:1 是完整的標(biāo)志，1:1 對(duì)大部分實(shí)驗(yàn)也是可以接受的。

6：去除 DNA – 用于 RT-PCR, array analysis 最好用 Dnase I 去除 DNA。

7：降低外源酶的污染 – 不能從外面又導(dǎo)入酶。

8：低濃度的核酸濃縮時(shí)，要加入助沉淀試劑。但要防止助沉淀劑含酶及 DNA 污染。

9：徹di底溶解 RNA，必要時(shí)可以 65C 加熱 5 分鐘。

10：合適的保存方法 – 短時(shí)間可以 –20C 保存，長(zhǎng)期請(qǐng)保存于 –80C。

提高RNA得率

首先要意識(shí)到不同得樣品其 RNA 含量差別很大。高豐度 (2-4ug/mg) 的如肝臟，胰腺，心臟，中豐度 (0.05-2ug/mg) 的如腦，胚胎，腎臟，肺，胸腺，卵巢，低豐度 (<0.05ug/mg) 的如膀胱，骨，脂肪。

1：裂解細(xì)胞使 RNA 釋放出來(lái) – RNA 如果不被釋放出來(lái)，得率是會(huì)降低的。電動(dòng)勻漿比其它勻漿方法效果更好，但也可能需要結(jié)合其它得方法，如液氮搗碎，酶消化 (Lysozyme/Lyticase)

2：抽提方法的優(yōu)化。基于苯ben酚的方法的最大問(wèn)題是分層不徹di底和部分 RNA 的丟失(不能全部將上清取出)。分層不徹di底是因?yàn)楹怂岷偷鞍踪|(zhì)含量高，可以用增加裂解液使用量或者降低樣品量解決。脂肪組織要增加一步氯仿抽提。RNA 的丟失可以用反抽方法或者去除有機(jī)層后再離心的方法降低。基于柱離心式方法的最大問(wèn)題是樣品過(guò)量。