RNA抽提的竅門(mén)
1:快速阻止 Rnase 活性 – 樣品收集后快速冷凍,裂解時(shí)快速操作滅活 Rnase。
2:選擇合適的抽提方法 – 高核酶含量的組織,脂肪組織最好用含苯ben酚的方法。
3:預(yù)判質(zhì)量要求 – Northern,cDNA 文庫(kù)構(gòu)建對(duì)完整性要求高,RT-PCR, RPA (Ribonuclease protection assay) 對(duì)完整性要求不是很高。RT-PCR 對(duì)純度 (酶抑制物殘留) 要求很高。
4:徹di底勻漿是提高得率和降低降解的關(guān)鍵。
5:檢查 RNA 的完整性 – 電泳檢測(cè),28S:18S =2:1 是完整的標(biāo)志,1:1 對(duì)大部分實(shí)驗(yàn)也是可以接受的。
6:去除 DNA – 用于 RT-PCR, array analysis 最好用 Dnase I 去除 DNA。
7:降低外源酶的污染 – 不能從外面又導(dǎo)入酶。
8:低濃度的核酸濃縮時(shí),要加入助沉淀試劑。但要防止助沉淀劑含酶及 DNA 污染。
9:徹di底溶解 RNA,必要時(shí)可以 65C 加熱 5 分鐘。
10:合適的保存方法 – 短時(shí)間可以 –20C 保存,長(zhǎng)期請(qǐng)保存于 –80C。
提高RNA得率
首先要意識(shí)到不同得樣品其 RNA 含量差別很大。高豐度 (2-4ug/mg) 的如肝臟,胰腺,心臟,中豐度 (0.05-2ug/mg) 的如腦,胚胎,腎臟,肺,胸腺,卵巢,低豐度 (<0.05ug/mg) 的如膀胱,骨,脂肪。
1:裂解細(xì)胞使 RNA 釋放出來(lái) – RNA 如果不被釋放出來(lái),得率是會(huì)降低的。電動(dòng)勻漿比其它勻漿方法效果更好,但也可能需要結(jié)合其它得方法,如液氮搗碎,酶消化 (Lysozyme/Lyticase)
2:抽提方法的優(yōu)化。基于苯ben酚的方法的最大問(wèn)題是分層不徹di底和部分 RNA 的丟失(不能全部將上清取出)。分層不徹di底是因?yàn)楹怂岷偷鞍踪|(zhì)含量高,可以用增加裂解液使用量或者降低樣品量解決。脂肪組織要增加一步氯仿抽提。RNA 的丟失可以用反抽方法或者去除有機(jī)層后再離心的方法降低。基于柱離心式方法的最大問(wèn)題是樣品過(guò)量。