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細(xì)胞裂解液各成分的作用與制備過程
點(diǎn)擊次數(shù):587 更新時(shí)間:2023-06-20

細(xì)胞裂解液各成分的作用:

1、第一種50mmol/L Tris-HCl是緩沖液,保證細(xì)胞裂解時(shí)PH值也能穩(wěn)定,Tris是一種有機(jī)堿。

2、第二種1.0 mmol/L EDTA是一種金屬螯合劑。

3、第三種150 mmol/L NaCl是等滲體系電解質(zhì),用于協(xié)調(diào)細(xì)胞膜內(nèi)外離子平衡。

4、第四種0.1% SDS是十二烷基硫酸鈉,是一種表面活性劑和還原劑,有增溶作用。

制備細(xì)胞裂解液實(shí)驗(yàn)流程:

1. 收集yi蛋白酶消化的細(xì)胞并離心,用PBS清洗。

2. 用100μl 裂解緩沖液冰浴溶解沉淀10min(每500000個(gè)細(xì)胞20μl裂解緩沖液)。

3. 10000rpm,4°C離心10min,取上清轉(zhuǎn)移至新管。

4. 用考馬斯亮藍(lán)法檢測蛋白質(zhì)濃度。

5. 用裂解緩沖液將溶液濃度調(diào)到5mg/ml,每小瓶中放100μl,-80°C儲存。

6. 按照1:1體積比混合2×樣品緩沖液,煮沸5min后,室溫放置5min。

7. 短時(shí)離心后點(diǎn)樣電泳檢測。

溶液準(zhǔn)備:

裂解緩沖液:
0.15M NaCl, 5mM EDTA(pH 8.0), 1% Triton×100, 10mM Tris-Cl(pH 7.4); 使用前加 5mM DTT, 0.1mM PMSF 異丙醇和5mM ε-氨ji己酸

2×樣品緩沖液:
130mM Tris-HCl(pH8.0), 20%(v/v)甘油, 4.6%(w/v)SDS, 0.02%溴酚藍(lán), 2%DTT

PBS(pH7.4):
10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4, 50mM NaCl, 2.7mM KCl


 


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