一)免疫組化染色假陽(yáng)性及其對(duì)策
1、消除內(nèi)源酶的影響在涉及免疫過(guò)氧化酶的各種染色中,均用過(guò)氧化物酶來(lái)標(biāo)記抗體,酶的作用是催化底物,使顯色劑顯色,正常組織中也含有一定量的過(guò)氧化物酶,其同樣也能催化底物顯色,而影響免疫組化染色的特異性,因此在加入標(biāo)記酶前應(yīng)設(shè)法將其滅活,以保證染色反應(yīng)的特異性。
通常情況下,去除內(nèi)源酶的方法是先用3%的過(guò)氧化qin溶液作用,但在含有豐富血細(xì)胞的標(biāo)本中,由于血細(xì)胞中存在大量具有活性的過(guò)氧化物酶,能與過(guò)氧化氫產(chǎn)生強(qiáng)烈的反應(yīng),產(chǎn)生氣泡而破壞組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)。在OCT包埋的冰凍切片中,使用3%的過(guò)氧化氫化溶液亦會(huì)產(chǎn)生類似現(xiàn)象。此時(shí)可用3%的過(guò)氧化氫甲醇溶液孵育20分鐘的方法滅活內(nèi)源性酶。
滅活內(nèi)源酶對(duì)正確判斷含血細(xì)胞較多的標(biāo)本,如骨髓、胎盤、脾等的染色結(jié)果十分重要。同樣,正常細(xì)胞也含生物su,尤以肝、脾、腎組織含量為多。在應(yīng)用親和素試劑的染色中,內(nèi)源性生物su易結(jié)合后繼抗體,形成親和素(或鏈親合素)-生物su復(fù)合物,導(dǎo)致假陽(yáng)性發(fā)生。消除這種非特異性著色的方法,是在采用生物su方法染色前,對(duì)標(biāo)本進(jìn)行親和素處理,使其結(jié)合位點(diǎn)飽和。
2、抗體導(dǎo)致的非特異性著色高純度、高效價(jià)的抗體是免疫組化染色的關(guān)鍵。出現(xiàn)下列情況時(shí),可能發(fā)生非特異性著色。
(1)因抗原不純而導(dǎo)致制備的抗體不純,常見于多克隆抗體。可用親和層析的方法除去非特異性抗體或應(yīng)用高純度的抗原制備抗體,采用單克隆抗體能避免非特異著色。
(2)標(biāo)本片中含有與靶抗原相似的抗原決定簇,解決的方法只有采用針對(duì)更具特異性抗原決定簇的單克隆抗體。
3、消除非特異性背景著色
非特異性著色最常見的情況是蛋白質(zhì)(抗體)吸附到組織切片中高度荷電的膠原及結(jié)締組織成分上,防止非特異性背景著色的方法之一是在滴加一抗前在標(biāo)本上加一種無(wú)關(guān)的蛋白質(zhì)溶液,封閉荷電點(diǎn)不給一抗留有吸附余地,以保證一抗不會(huì)吸附到膠原纖維及結(jié)締組織成分上。最chang用的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)溶液是所用二抗的同種動(dòng)物非免疫血清。用產(chǎn)生二抗的同種動(dòng)物血清,是為了避免二抗與預(yù)先加入的蛋白質(zhì)結(jié)合引起假陽(yáng)性染色。
用來(lái)阻斷非特異性結(jié)合的血清不能有任何溶血現(xiàn)象。紅細(xì)胞破裂會(huì)使其中的過(guò)氧化酶與底物作用,產(chǎn)生非抗原特異性的陽(yáng)性著色。多克隆抗體因其成分復(fù)雜,更易造成背景染色。稀釋液采用含1%BASpH7.4的PBS,同時(shí)在洗液中加入0.05%的吐溫20(Tween20)有助于消除背景染色。
4、消除病理性色素的影響
當(dāng)所檢動(dòng)物由于出血等原因造成吞噬含鐵血黃素細(xì)胞增多時(shí),為防止其與DAB顯色呈現(xiàn)的黃褐色發(fā)生混淆,最好選用AEC顯色劑。組織固定時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí),切片中容易產(chǎn)生福爾馬林色素顆粒,影響結(jié)果觀察,取材時(shí)應(yīng)充分用流水沖洗,以消除影響。
5、切片制作不當(dāng)引起的非特異性著色在嚴(yán)重變性、壞死及炎性病灶處,在膠原纖維和結(jié)締組織部位,在切片裱貼不平、折皺處以及組織邊緣部位常會(huì)出現(xiàn)非特異性著色。其中有的是因組織荷電狀態(tài)改變而吸附抗體;有的機(jī)理不明;有的可能與組織邊緣或皺折深部的槽形構(gòu)型有關(guān),解決的辦法是在滴加一抗前,以二抗動(dòng)物的正常血清(5%~10%)封閉、飽和電荷吸附位點(diǎn)和改善取材與制片技術(shù)。
6、清洗不充分而造成的非特異性著色應(yīng)嚴(yán)格操作規(guī)程。緩沖液中含一定量的鹽,其有利于減低背景著色,通常使用0.05mlo/LPBS,溶液內(nèi)加入吐溫20,效果更佳。特殊標(biāo)記時(shí),試劑公司一般都提供緩沖液的配方。另外,在清洗后至加入下一步試劑前,不能干片,干片的部位會(huì)出現(xiàn)非特異著色。
7、DBA顯色產(chǎn)生的某些背景顏色使用濃縮型DAB試劑盒時(shí),請(qǐng)嚴(yán)格按照說(shuō)明書標(biāo)明的滴加順序操作,注意校正蒸鎦水的pH值,以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性。粉劑DBA溶解時(shí),常有一些不溶性顆粒,這些顆粒須經(jīng)過(guò)濾除去。否則可能沉積于切片組織上,產(chǎn)生斑點(diǎn)狀著色。另外,DAB保存不妥產(chǎn)生氧化物亦可沉積于切片上,因此需將DAB保存于避光干燥處,現(xiàn)用現(xiàn)配,臨用前加H2O2.
(二)免疫組化染色的假陰性及其對(duì)策
通常可因標(biāo)本抗原保存,試劑質(zhì)量及染色操作等因素引起假陰性。
1、組織處理不當(dāng)固定不及時(shí)或固定時(shí)間過(guò)長(zhǎng)常導(dǎo)致抗原丟失。浸蠟溫度過(guò)高,時(shí)間過(guò)長(zhǎng)將破壞抗原的抗原性。應(yīng)改善技術(shù)條件,重新取材。
2、抗原修復(fù)由于目前所進(jìn)行的常規(guī)石蠟切片標(biāo)本均用甲醛固定,所形成的醛健、羧甲鍵等封閉了部分抗原決定簇,或由于蛋白之間發(fā)交聯(lián)而使抗原決定簇隱蔽,因此在染色時(shí),有些抗原需要先進(jìn)行抗原修復(fù)或暴露。至于哪種抗原需要進(jìn)行修復(fù),需在建立染色程序時(shí)經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定。抗原修復(fù)分為化學(xué)方法和物理/化學(xué)方法。
(1)化學(xué)方法:主要是通過(guò)一些酶的作用,使抗原決定簇暴露。常用的酶有:胰yi蛋白酶、胃蛋bai酶、尿素、皂素等。需根據(jù)需要使用。
(2)物理/化學(xué)方法:主要有以下幾種
①單純加熱方法:將片子放入裝有檸檬酸鹽緩沖液的容器中,加熱至沸騰,并持續(xù)10~15分鐘,此方法操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì),適用于所有實(shí)驗(yàn)室,但對(duì)封閉牢固的抗原決定簇暴露不理想。
②高壓加熱方法:將片子放入裝有檸檬酸鹽緩沖液的高壓鍋中,加熱至噴氣,并持續(xù)1~2分鐘。
③微波方法:將片子放入裝有檸檬酸鹽緩沖液的容器中,置微波爐加熱至95℃以上,并持續(xù)10~15分鐘,室溫20~30分鐘自然晾涼,使蛋白復(fù)性。此方法不僅利用熱效應(yīng),且可通過(guò)微波的直接作用,打開蛋白之間的交聯(lián)鍵,將已被封閉的抗原決定簇暴露和修復(fù)。
3、一抗的選用、稀釋度及孵育時(shí)間第一抗體是免疫組化染色中最重要的試劑。應(yīng)用何種一抗,應(yīng)根據(jù)具體目的和要求決定。臨床病原診斷,要求較高的敏感性和較廣的識(shí)別譜時(shí),可選用多克隆抗體或幾株混合的單克隆抗體,來(lái)避免抗體反應(yīng)譜過(guò)窄造成的假陰性。某些研究工作需要檢測(cè)單一抗原決定簇的存在,此時(shí)必須選用單克隆抗體。一抗的參考稀釋度常由“方格滴定"和相關(guān)檢測(cè)結(jié)果推測(cè)得出,但因?qū)嶒?yàn)條件不同,對(duì)抗原活性的影響不同,最佳稀釋度仍需經(jīng)過(guò)摸索。任何一個(gè)抗體,其工作稀釋度取決于如下因素:
(1)抗體的滴度即特異性抗體濃度;
(2)抗體的純度,即抗體中雜蛋白的濃度。雜蛋白較高時(shí),需要較高的稀釋度;
(3)孵育的時(shí)間,時(shí)間越長(zhǎng),所用的抗體稀釋倍數(shù)越高;
(4)組織中抗原含量對(duì)抗體的應(yīng)用濃度有不同的要求。在免疫反應(yīng)中,過(guò)多的抗體將導(dǎo)致陰性結(jié)果,這種現(xiàn)象類似于凝集反應(yīng)中的前帶現(xiàn)象。因此需用“方格滴定"的方法找出適當(dāng)?shù)南♂尪龋?br/>
并得到最大強(qiáng)度的抗原染色和最di的背景著色。一般認(rèn)為,某一稀釋度下特異性染色較強(qiáng)且無(wú)背景著色,是較理想的稀釋度,加長(zhǎng)孵育時(shí)間可有效地降低所用抗體的濃度,有利于提高染色質(zhì)量,節(jié)省抗體,可用37℃0.5h或4℃過(guò)夜的方法。只要控制好溫度、抗體稀釋度和孵育時(shí)間,一般都能得到理想的染色效果。
4、選擇適宜的二抗二抗應(yīng)用中常出現(xiàn)的總是是抗體本身與一抗不匹配,如抗兔的二抗,匹配鼠來(lái)源的一抗;或以抗鼠的二抗匹配兔來(lái)源的一抗,都會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。
5、試劑造成的影響酶的活性降低,緩沖液內(nèi)加有疊氮鈉抑制了酶活性,底物中所加H2O2量少或失效,操作中漏加了某種試劑等,都會(huì)造成假陰性結(jié)果。如陽(yáng)性對(duì)照不成立,則需認(rèn)真檢查操作程序,查找可能的原因。