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過氧化物酶和堿性磷酸酶相關介紹
點擊次數(shù):489 更新時間:2023-05-25

  用于標記抗體或抗抗體的酶須具有下列特性:有高度的活性和敏感性;在室溫下穩(wěn)定;反應產(chǎn)物易于顯現(xiàn);能商品化生產(chǎn)。當前應用較多的有辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等,其中以HRP應用最guang。

  過氧化物酶

  過氧化物酶廣泛分布于植物中,辣根中含量最高,從辣根中提取的稱辣根過氧化物酶(HRP),是由無色酶蛋白和深棕色的鐵卟啉構成的一種糖蛋白(含糖量18%),分子量約40 000,約由300個氨基酸組成,等電點為pH 3-9,催化反應的最適pH值因供氫體不同而稍有差異,一般多在pH 5左右。此酶溶于水和50%飽和度以下的硫酸銨溶液。酶蛋白和輔基的最大吸收光譜分別為275nm和403nm。

  酶的純度以RZ表示:RZ=OD403/OD275

  純酶的RZ多在3.0以上,最高為3.4。RZ在0.6以下的酶制品為粗酶,非酶蛋白約占 75%,不能用于標記。RZ在2.5以上者方可用于標記。HRP的作用底物為過氧化氫,催化反應時的供氫體有幾種:(1)鄰苯二胺(OPD),產(chǎn)物為橙色,可溶性,敏感性高,最大吸收值在490nm,可用肉眼觀察判別,容易被濃H2SO4終止反應,顏色可在數(shù)小時內(nèi)不改變,是目前國內(nèi)ELISA中最chang用的一種;(2)聯(lián)大茴香胺(OD),產(chǎn)物為橘黃色,最大吸收值在400nm,顏色較穩(wěn)定;(3)5-氨基水楊酸(5-AS):產(chǎn)物為深棕色,最大吸收值在449nm,部分溶解,敏感性較差;(4)鄰聯(lián)甲苯胺(OT)產(chǎn)物為藍色,最大吸收值在630nm,部分溶解,不穩(wěn)定,不耐酸,但反應快,顏色明顯。

  堿性磷酸酶

  系從小牛腸粘膜和大腸桿菌中提取,由多個同功酶組成。它們的底物種類很多,常用者為硝基苯磷酸鹽,廉價無毒性。酶解產(chǎn)物呈黃色,可溶,最大吸收值在400nm。酶的活性以在pH10反應系統(tǒng)中,37℃1分鐘水解1μg磷酸苯二鈉為一個單位。

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