實(shí)驗(yàn)概要
本實(shí)驗(yàn)介紹了根癌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞的制備及凍融法轉(zhuǎn)化。
主要試劑
利fu平,LB培養(yǎng)基,NaCl,CaCl2,YEP培養(yǎng)基,ka那霉素
主要設(shè)備
搖床,高速離心機(jī),低溫冰箱,水浴鍋
實(shí)驗(yàn)材料
根癌農(nóng)桿菌GV3101單菌落
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 根癌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞的制備
1) 挑取單菌落GV3101,接種于5mL附加有50mg/L的利fu平的液體LB培養(yǎng)基中,28℃,200rpm,過(guò)夜;
2) 取2mL培養(yǎng)物至50mL液體LB培養(yǎng)基中,繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為0.5左右;
3) 將培養(yǎng)物冰浴30min,4℃,5000rpm,離心5min,棄上清;
4) 用l0mL 0.lmol/L冷的NaCl懸浮菌體;
5) 4℃,5000rpm,離心5min,棄上清;
6) 1 mL 20mmo1/L冷的CaCl2懸浮,分裝成50uL/管,液氮速凍后,-80℃保存。
2. 凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
1) 冰浴融化農(nóng)桿菌LBA4404/GV3101感受態(tài)細(xì)胞;
2) 加入3ul表達(dá)載體質(zhì)粒,冰浴30min,液氮中凍1 min,然后在37℃水浴5min;
3) 加入950uL無(wú)抗生素的YEP培養(yǎng)基,28℃,200rpm,振蕩培養(yǎng)4h;
4) 1 0000rpm離心1 min以濃縮菌液,用100uL YEP回溶菌體;
5) 將回溶后的菌體涂于附加50mg/L卡na霉素和100mg/L利fu平的固體YEP培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)36-48h。菌液PCR檢測(cè)陽(yáng)性克隆。