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細胞爬片免疫熒光實驗操作步驟
點擊次數:456 更新時間:2023-05-18

細胞爬片免疫熒光步驟:

1.遠慕生物細胞爬片;首先是玻片的處理,普通的蓋玻片用砂輪劃成自己要的大小的小方塊,先用洗衣粉洗干凈,用水沖靜烤干,然后泡酸過夜,撈酸后流水洗凈,烤干,置于器皿中高壓滅菌,然后再烤箱中大約8小時烤干備用。

爬片可以在培養皿 六孔板或24孔板中都可,我選擇在培養皿中爬。一為節約經費(培養皿可以重復利用)二來覺得培養皿口大,操作比較方便。培養皿消毒同上,消毒時記得消兩把鑷子

具體操作是:用胰yi酶消化好細胞,充分吹打,使之成單細胞懸液(注意:這一點很重要,關系到將來爬出來片子的質量)

取出消毒的培養皿,可以先加少量培養基(以使玻片與培養皿緊密接觸),將玻片小心放入擺放其中,然后將單細胞懸液一滴一滴的滴到玻片上。最后蓋上培養皿置于37度5%CO2的暖箱中培養,根據細胞生長狀況,24小時或更長時間適時取出爬片。

爬片置于37度PBS中洗三次,每次3到5秒鐘,然后在4%多聚甲醛中固定15分鐘,然后再用37度去離子水將甲醛沖干凈,注意手法輕柔,要不然掉片很厲害。同時操作過程中注意玻片的正反面,要不然真的是前功盡棄。

將做好的爬片置于濾紙上晾干,然后用中性樹膠粘在載玻片上。注意一定要等中性樹膠徹di干了之后才能做后續實驗,要不然玻片會掉下來的,就又是前功盡棄了 做好的細胞爬片可以放在-20保存備用,具體能保存多長時間不太清楚,當然盡量早用。

2.4%多聚甲醛固定10min(固定細胞器用預冷的70%甲醇+30%丙酮);

3.PBS漂洗5min;

4.0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化處理);

5.PBS漂洗2次,每次5min;

6.1%BSA封閉30min;

7.加入1%BSA稀釋的一抗,于37℃雜交2h;

8.PBS漂洗2次,每次5min;

9.加入1%BSA稀釋的二抗,于37℃雜交1h;

10.PBS漂洗2次,每次5min;

11.5ug/ml DAPI染色2min;

12.抗淬滅封片劑封片。

抗淬滅封片劑:

2.5% DABCO (w/v)

50mM Tris(pH8.0)

90%甘油

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