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遠慕簡述巨噬細胞的分離和純化
點擊次數:286 更新時間:2023-04-10

  1、取2~3公斤重的家兔,耳緣靜脈注射10ml空氣處死動物或注射2ml(含130mg)戊巴bi妥麻醉動物。仰臥固定,消毒胸部,剪開胸壁。以下過程注意無菌操作。小心從環狀軟骨下方剪下氣管,分離心臟和血管,取出肺,剪去脂肪和結締組織。用無菌紗布小心擦凈肺表面,稱重。

  2、分離肺泡巨噬細胞:用夾子夾住氣管,使肺懸空。向氣管中注射40ml無菌的冷生理鹽水,讓生理鹽水進入全部肺泡。用鑷子提起氣管,從夾子下面剪斷氣管,將肺中的液體倒入離心管中。再用同樣方法,用40ml無菌冷生理鹽水沖洗肺泡,合并浸出液,置4℃。

  3、分離肺組織中的巨噬細胞:取出肺泡巨噬細胞后,剪去氣管,將肺組織放在有冷RPMI-1640培養液的平皿中。平皿置冰上,用吸滿冷RPMI-1640培養液的20ml注射器接23號針頭,一邊灌注一邊用針頭梳離肺組織,直到肺組織與支氣管樹全部分離。使肺組織通過00目的鋼絲網,分離單細胞。

  4、以下過程均在4℃中進行。分別處移動圖片理肺泡巨噬細胞和肺組織中的巨噬細胞:離心200×g10分鐘,去上清液。輕彈試管,懸浮細胞,加入10ml低滲液(20mmol/LTris,0.75%氯化銨,pH7.4),37℃處理3~5分鐘,溶解紅細胞。紅細胞通常分別占肺泡巨噬細胞和組織巨噬細胞的1%和10%。也可以不用低滲處理,直接在淋巴細胞分離液上分離巨噬細胞。

  5、離心200×g10分鐘,去上清液。用RPMI-1640培養液洗滌細胞一次。將細胞懸液加在淋巴細胞分離液(比重1.077)上,離心400×g20分鐘,收集交界面的巨噬細胞。棄去沉淀的死細胞和紅細胞。

  6、用RPMI-1640培養液洗滌巨噬細胞2次。臺盼藍染色檢測細胞活力和細胞數,將細胞配成所需濃度。此時巨噬細胞活力可達90%以上,巨噬細胞占全部細胞的90%以上。

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