膠原纖維在HE染色法被染成粉紅色,除此之外,它還可以用一些陰離子的染料來進(jìn)行染色,如用淡綠可把它們?nèi)緸榫G色,用甲苯胺藍(lán)可將其染為藍(lán)色,在網(wǎng)狀纖維染色中,如不加以處理,它又可被染為棕黃色。常用的特殊染色法有Van Gieson.Masson和Mallary等方法。在免疫細(xì)胞化學(xué)染色中,膠原纖維由于含的負(fù)電荷過多,常導(dǎo)致某些非特異性的染色,應(yīng)特別注意。
(一).Van Gieson(V.G)染色法
I. 試劑的配制:
weigert氏蘇木素
A液: 蘇木素 1g (haematoxylin)
* 100ml
B液: 30%三氯化鐵 4ml (ferric chloride)
蒸餾水 95ml
鹽酸 1ml
II.Van Gieson氏液
A液: 酸性品紅 1g(acid fuchsin)
蒸餾水 100ml
B液: ku味酸飽和水溶液,(1.22%)(picric acid)
注意事項(xiàng):
1、Weigert氏蘇木素臨用前取A液和B液等份混合,幾個(gè)小時(shí)內(nèi)用完,最長不得超過一天。
2、蘇木素配后經(jīng)二十多天才能成熟,必須提前配制。
3、該液能抵抗弱酸性染液,對已著染的細(xì)胞核在酸性染液的作用,不易被脫去顏色,如果不特別深染,則無須分化。
4、Van Gieson氏液取B液9ml,加入A液1ml,即可使用。
操作方法:(后面的各種方法,如沒特別說明,都在室溫下進(jìn)行)
1、切片脫蠟至水,
2、用Weigert氏蘇木素染20min,
3、水洗,必要時(shí)可分化,
4、流水沖洗10min,
5、染Van Gieson氏液1min,
6、用95%酒精快速分化,
7、*脫水,二甲苯透明,封固。
結(jié)果:
膠原纖維:鮮紅色,肌纖維: 黃色,紅細(xì)胞: 黃色,細(xì)胞核: 藍(lán)黑或灰色。
注意事項(xiàng):
1、該法染完的切片,較易褪色如需照相,應(yīng)盡早完成。
2、蘇木素染液如為棕色或沉淀,應(yīng)將其拋棄。
3、分化用的酒精,應(yīng)使用95%以上的酒精,低濃度的酒精褪色能力強(qiáng),容易將著染的紅色脫去。
4、切片也可以用天青蘭蘇木素替代Weigert氏蘇木素,染核效果基本一樣。
(二).Masson氏三色染色法:天青石藍(lán)液的配制:天青石藍(lán)(Celestin blue B) 1.25g 硫酸鐵銨(ferric ammonium sulfate)1.25g
蒸餾水 200ml
甘油(glycerin) 30ml
將前兩者溶于蒸餾水中,然后煮沸,冷卻后過濾,再加入甘油和she香草酚。
Mayer氏蘇木素的配制蘇木素 0.1g 蒸餾水 100ml
鉀明礬(Potassium alum) 5g
檸檬酸(Citric acid) 0.1g
水合lv醛(Chloral hydrate)20mg
配制法:
將蘇木素放入蒸餾水中,用玻棒不停地?cái)嚢柚敝羨an全溶解,再依次加入鉀明礬,檸檬酸和水合lv醛,再繼續(xù)攪拌,最后加入碘酸鈉,攪拌均勻,即可使用。
麗春紅酸性品紅液的配制: 麗春紅(ponceau 2R) 0.7g
酸性品紅(acid fuchsin)0.3g
冰醋酸 1ml
蒸餾水 99ml
操作方法:
1、切片脫蠟至水,
2、1%高錳suan鉀氧化切片5min,
3、水洗,草酸漂白1min,
4、水洗,蒸餾水洗,天青石藍(lán)染5min水洗,
5、摔去余液不用水洗,滴染Mayer氏蘇木素3-5min,
6、流水沖洗5-10min,
7、麗春紅ku味酸飽和液染5min,
8、1%醋酸水溶液洗,
9、1%磷鉬酸分化切片約5min,
10、蒸餾水洗,
11、1%淡綠或者甲苯胺藍(lán)滴染30s,
12、1%醋酸水溶液洗切片,
13、95%酒精分化,*脫水,
14、二甲苯透明,中性樹膠封固。
結(jié)果: 膠原纖維呈現(xiàn)綠色或藍(lán)色,細(xì)胞核呈現(xiàn)灰黑或灰藍(lán)色,肌肉和胞質(zhì)紅細(xì)胞呈現(xiàn)紅色。
注意事項(xiàng):①M(fèi)asson氏染液配完后保存時(shí)間不宜過長,如有可能,每次染色以染配為佳,如何可使著色顏色的鮮艷性。②切片在各級酒精中脫水,時(shí)間不宜過長,否則會將著染的顏色脫去。③切片保存所著染的顏色顯長為1—2年以后會隨著時(shí)間的延長而逐漸褪去,應(yīng)予注意。④磷鉬酸和磷鎢酸在染色法中的作用各有不同,磷鉬酸作用于膠原纖維,磷鎢酸作用于纖維膠]質(zhì),肌膠質(zhì),神經(jīng)膠質(zhì)和上皮纖維等。上述兩種試劑的使用,可以促進(jìn)組織有選擇的染色,它們可以減少背景和核的染色,使背景清晰。⑤ 如有可能,在組織固定時(shí),用Zenker氏固定液固定,如此對染色效果將更好。
臨/床應(yīng)用:
1、與淀粉樣物的區(qū)別: 膠原纖維發(fā)生病變?nèi)鐗乃阑蛲该髯冃詴r(shí),它與淀粉樣物在HE染色時(shí)被染為粉紅色,不好區(qū)別。應(yīng)用V.G染色法,能將膠原纖維染為粉紅色,而淀粉樣物將被染為黃色。
2、應(yīng)用與間胚葉來源腫瘤的區(qū)別:
如纖維瘤(肉瘤),平滑肌、橫紋肌瘤(肉瘤),神經(jīng)纖維瘤(肉瘤)、惡性纖維組織細(xì)胞瘤等,由于都含有大量的纖維,HE染色均為紅色。應(yīng)用Masson氏染色法,可將膠原纖維染色藍(lán)色或綠色,肌源性組織被染為紅色。
3、應(yīng)用與其他慢性炎癥的區(qū)別。
如慢性闌尾炎,疤痕愈合時(shí),纖維愈復(fù)病灶可被染為鮮紅色或藍(lán)綠色,SARS病患者愈合后有的肺部可出現(xiàn)疤痕,粘連,此時(shí)可顯示藍(lán)色或綠色。
可用于鑒定肝硬化及創(chuàng)傷組織的修復(fù)程度。肝硬化時(shí)的肝組織有許多不同大小的假小葉,用上述方法顯示時(shí),可顯示出不同的組織結(jié)構(gòu)。V.G法可將包繞假小葉的膠原纖維染成紅色,膽汗呈綠色。
膠原纖維在上述的兩種方法中著染不同的顏色,如V.G著染紅色,Masson氏著染藍(lán)色或綠色。這主要取決于染料對組織的滲透、吸附、沉淀和反應(yīng),而染料分子量的大小是關(guān)鍵,分子量小的分子移動迅速,行動快,對組織的滲透性較強(qiáng),能穿透較為致密的組織。分子量大的染料分子移動較遲緩,滲透力較弱,可作用于組織強(qiáng)求構(gòu)較疏松的組織,染色時(shí)間可適當(dāng)延長。
在相關(guān)的染料中,分子量從小到大依次排列是:ku味酸(黃色):229.11;桔黃G(黃色):452;麗春紅(紅色):480.42;酸性品紅(紅色):585.53;苯胺藍(lán)(藍(lán)色):737.72;亮綠(綠色):792.72;甲基藍(lán)(藍(lán)色)>99。
染色是一個(gè)較為復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)和物理作用的雙重過程,在應(yīng)用這些方法時(shí),根據(jù)不同情況,選擇不同的方法,認(rèn)真地操作,方能獲得最佳的效果。