(一)堿裂解法提取質(zhì)粒

[實(shí)驗(yàn)原理]
堿裂解法提取質(zhì)粒是根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線(xiàn)性染色體DNA在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來(lái)分離它們。在pH值介于12.0~12.5這個(gè)狹窄的范圍內(nèi),線(xiàn)性的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)而被變性,盡管在這樣的條件下,共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA的氫鍵會(huì)被斷裂,但兩條互補(bǔ)鏈彼此相互盤(pán)繞,仍會(huì)緊密地結(jié)合在一起。當(dāng)加入pH4.8的乙酸鉀高鹽緩沖液恢復(fù)Ph至中性時(shí)，共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA的兩條互補(bǔ)鏈仍保持在一起，因此復(fù)性迅速而準(zhǔn)確，在而線(xiàn)性的染色體DNA的兩條互補(bǔ)鏈彼此已wan全分開(kāi)，復(fù)性就不會(huì)那么迅速而準(zhǔn)確，它們纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過(guò)離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)而被除去。

[實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備]
1.恒溫培養(yǎng)箱 2.恒溫?fù)u床
3.臺(tái)式離心機(jī)(最大轉(zhuǎn)速4000rpm) 4.冷凍高速離心機(jī)
5.高壓滅菌鍋 6.超凈工作臺(tái)
7.微量移液器 8.eppendorf tupe、tip

[實(shí)驗(yàn)材料]
1.葡萄糖 2.三羥甲基氨基甲/烷(Tris)
3.乙2胺四乙酸(EDTA) 4.氫氧/化鈉
5.十二烷基硫酸鈉(SDS) 6.乙酸鉀
7.冰乙酸 8.氯/仿
9.乙醇 10.胰RNA酶
11.氨芐青mei素 12.蔗糖
13.溴酚藍(lán) 14.酚
15.β巰基乙醇 16.鹽酸
17.含pUC18質(zhì)粒的大腸桿菌
附：試劑的配制

1.溶液Ⅰ
50mmol/L 葡萄糖
5mmol/L 三羥甲基氨基甲/烷(Tris) Tris·HCl (pH8.0)
10mmol/L 乙2胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)
2.溶液Ⅱ
0.4 mol/L NaOH, 2%SDS, 用前等體積混合
3.溶液Ⅲ
5mmol/L 乙酸鉀 60 ml
冰乙酸 11.5 ml
水 28.5 ml
4.TE緩沖液
10mmol/L Tris·HCl
1 mmol/L EDTA(pH8.0)
5.70%乙醇(放-20℃冰箱中,用后即放回)
6.胰RNA酶
將RNA酶溶于10mmol/L Tris·HCl(pH7.5)、15mmol/L NaCl中，配成10mg/ml的濃度，于100℃加熱15min,緩慢冷卻至室溫，保存于-20℃。
7.終止液:40%蔗糖、0.25%溴藍(lán)酚
8.酚

[實(shí)驗(yàn)步驟]

(一) 提取質(zhì)粒
1.將2ml含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基加入到試管中，接入含質(zhì)粒的大腸桿菌，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。
2.取1.5ml培養(yǎng)物倒入微量離心管中，4000rpm，離心2min。
3.吸去培養(yǎng)液，使細(xì)胞沉淀盡可能干燥。
4.將細(xì)菌沉淀懸浮于100μl溶液Ⅰ中，充分混勻，室溫放置10 min。
5.加200μl溶液Ⅱ(新鮮配制)，混勻內(nèi)容物，將離心管放冰上5 min。
6.加入150μl溶液Ⅲ(冰上預(yù)冷)，蓋緊管口，顛倒數(shù)次使混勻。
7.1200rpm，離心15 min，將上清轉(zhuǎn)至另一離心管中。
8.向上清中加入等體積酚：氯/仿(去蛋白)，反復(fù)混勻，12000rpm，離心5min,將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中.
9.向上清加入2倍體積乙醇,混勻后,室溫放置5-10min。12000rpm離心5min。倒去上清液，把離心管倒扣在吸水紙上，吸干液體。
10.用1ml70%乙醇洗滌質(zhì)粒DNA沉淀，振蕩并離心，倒去上清液，真空抽干或空氣中干燥。
11.加50μl TE緩沖液，其中含有20μg/ml的胰RNA酶，使DNAwan全溶解，-20℃保存。

(二)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA

[實(shí)驗(yàn)原理]
瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定和純化DNA片段的常用方法。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。由于糖磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動(dòng)。不同濃度瓊脂糖凝膠可以分離從200bp至50kb的DNA片段。在瓊脂糖溶液中加入低濃度的溴化乙錠(ethidum bromide ,EB)，在紫外光下可以檢出 10ng的DNA條帶，在電場(chǎng)中，pH8.0條件下，凝膠中帶負(fù)電荷的DNA向陽(yáng)極遷移。
瓊脂糖凝膠有如下特點(diǎn)：
(1) DNA的分子大小 在凝膠基質(zhì)中其遷移速率與堿基對(duì)數(shù)目的常用對(duì)數(shù)值成反比，分子越大遷移得越慢。
(2) 瓊脂糖濃度 一個(gè)特定大小的線(xiàn)形DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率(u)的對(duì)數(shù)與凝膠濃度(t)成線(xiàn)性關(guān)系。
(3) 電壓 低電壓時(shí)，線(xiàn)狀DNA片段遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加，不同分子量DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長(zhǎng)，隨著電壓的增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率達(dá)到最大，所加電壓不得超過(guò)5v/cm。
(4) 電泳溫度 DNA在瓊脂糖凝膠電泳中的電泳行為受電泳時(shí)的溫度影響不明顯，不同大小的DNA片段其相對(duì)遷移速率在4℃與30℃之間不發(fā)生明顯改變，但濃度低于0.5%的凝膠或低熔點(diǎn)凝膠較為脆弱，最好在4℃條件下電泳。
(5) 嵌入染料 熒光染料溴化乙錠用于檢測(cè)瓊脂糖凝膠中的DNA，染料嵌入到堆積的堿基對(duì)間并拉長(zhǎng)線(xiàn)狀和帶缺口的環(huán)狀DNA,使其剛性更強(qiáng),還會(huì)使線(xiàn)狀遷移率降低15%。
(6) 離子強(qiáng)度 電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA電泳遷移率。在沒(méi)有離子存在時(shí)(如誤用蒸餾水配制凝膠，電導(dǎo)率最小，DNA幾乎不移動(dòng)，在高離子強(qiáng)度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液)，則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起凝膠熔化。
對(duì)于天然的雙鏈，常用的幾種電泳緩沖液有TAE、TBE等，一般配制成濃縮母液，室溫保存，用時(shí)稀釋。

[實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備]
1. 恒溫培養(yǎng)箱
2. 瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)
3. 高壓滅菌鍋
4. 紫外線(xiàn)透射儀

[實(shí)驗(yàn)材料]
1.三羥甲基氨基甲/烷(Tris) 2.硼/酸
3.乙2胺四乙酸(EDTA) 4.溴酚藍(lán)
5.蔗糖 6.瓊脂糖
7.溴化乙錠 8.DNA marker
9.DNA樣品

[實(shí)驗(yàn)步驟]
1.緩沖液的配制
① 5×TBE(5倍體積的TBE貯存液)
配1000ml 5×TBE:
Tris 54g
硼/酸 27.5g
0.5mol/l EDTA 20ml
Ph8.0
② 凝膠加樣緩沖液(6×)
溴酚藍(lán) 0.25%
蔗糖 40%
③溴化乙錠溶液(EB) 0.5μg/ml

2.制備瓊脂糖凝膠
按照被分離DNA的大小,決定凝膠中瓊脂糖的百分含量。可參照下表：
瓊脂糖凝膠濃度 線(xiàn)性DNA的有效分離范圍
0.3% 5-60 kb
0.6% 1-20 kb
0.7% 0.8-10 kb
0.9% 0.5-7 kb
1.2% 0.4-6 kb
1.5% 0.2-4 kb
2.0% 0.1-3 kb

3.膠板的制備
(1) 用高壓滅菌指示紙帶將洗靜、干燥的玻璃板的邊緣(或電泳裝置所皿備的塑料盤(pán)的開(kāi)口)封住，形成一個(gè)膠膜(將膠膜放在工作臺(tái)的水平位置上，用水平儀校正)。
(2) 配制足夠用于灌滿(mǎn)電泳槽和制備凝膠所需的電泳緩沖液(1×TBE)。準(zhǔn)確稱(chēng)量的瓊脂糖粉。緩沖液不宜超過(guò)錐瓶或玻璃瓶的50%容量。 在電泳槽和凝膠中務(wù)必使用同一批次的電泳緩沖液，離子強(qiáng)度或pH值的微小差異會(huì)在凝膠中形成前沿，從而大大影響DNA片段的遷移率 。
(3) 在錐瓶的瓶頸上松松地包上一層厚紙。如用玻璃瓶，瓶蓋須擰松。在沸水浴或微波爐中將懸浮加熱至瓊脂糖溶解。注意：瓊脂糖溶液若在微波爐里加熱過(guò)長(zhǎng)時(shí)間，溶液將過(guò)熱并暴沸。應(yīng)核對(duì)溶液的體積在煮沸過(guò)程中是否由于蒸發(fā)而減少，必要時(shí)用緩沖液補(bǔ)充。
(4) 使溶液冷卻至60℃。加入溴化乙錠(用水配制成10mg/ml的貯存液)到終濃度為0.5ug/ml，充分混勻。
(5) 用移液器吸取少量瓊脂糖溶液封固膠模邊緣，凝固后，在距離底板0.5-10mm的位置上放置梳子，以便加入瓊脂糖后可以形成完好的加樣孔。如果梳子距玻璃板太近，則拔出梳子時(shí)孔底將有破裂的危險(xiǎn)，破裂后會(huì)使樣品從玻璃板之間滲透。
(6)將剩余的溫?zé)岘傊侨芤旱谷肽z模中。凝膠的厚度在3-5mm之間。檢查一下梳子的齒下或齒間是否有氣泡。
(7)在凝膠wan全凝固后(于室溫放置30-45分鐘) ，小心移去梳子和高壓滅菌紙帶，將凝膠放入電泳槽中。
低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠及濃度低于0.5%的瓊脂糖凝膠應(yīng)冷卻至4℃，并在冷庫(kù)中電泳。
(8)加入恰好沒(méi)過(guò)膠面約1mm深的足量電泳緩沖液。

4.加樣
DNA樣品與所需加樣緩沖液混合后，用微量移液器，慢慢將混合物加至樣品槽中。此時(shí)凝膠已浸沒(méi)在緩沖液中。 一個(gè)加樣孔的最大加樣量依據(jù)DNA的數(shù)量及大小而定，一般為20-30μl樣品。
已知大小的DNA標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)同時(shí)加在凝膠的左凝膠的左側(cè)和右側(cè)孔內(nèi)。確定未知DNA的大小。測(cè)量未知DNA的大小時(shí)，要所有樣品都用相同的樣品緩沖液。

5.電泳
在低電壓條件下,線(xiàn)形DNA片段的遷移速度與電壓成比例關(guān)系,但是,在電場(chǎng)增加時(shí),不同相對(duì)分子質(zhì)量的DNA片段泳動(dòng)度的增加是有差別的。因此，隨著電壓的增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍隨之減小。為了獲得電泳分離DNA片段的最大分辨率，電場(chǎng)強(qiáng)度不應(yīng)高于5V/cm。當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑移到到距離膠板下沿約1-2cm處，停止電泳。