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RNase A/核糖核酸酶A的主要用途介紹
點擊次數:778 更新時間:2023-02-23

核糖核酸酶A(RNase A)來源于牛胰臟,是一種內切核糖核酸酶,可特異攻擊RNA上嘧啶殘基的3’端,切割胞嘧啶或尿mi啶與相鄰核苷酸形成的磷酸二酯鍵,反應終產物是3’嘧啶核苷酸和末端帶3’嘧啶核苷酸的寡核苷酸。無輔助因子及二價陽離子存在時,核糖核酸酶A的作用可以被胎盤RNA酶抑制劑(RNasin)或氧釩一核糖核苷復合物(vanadyl—ribonuclosidecomplex,VRC)所抑制。RNase A的反應條件極廣,且極難失活。在低鹽濃度(0~100 mmol/l NaCl)下,RNase A切割單鏈和雙鏈RNA、DNA:RNA雜交體中的RNA;當NaCl濃度為300 mmol/l。或更高時,RNase A就特異性切割單鏈RNA。去除反應液中的RNase A,通常需要蛋白酶K處理、酚反復抽提和乙醇沉淀。

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在分子克隆中,核糖核酸酶A的主要用途為:

①從DNA:RNA雜交體中去除未雜交的RNA區。

②確定RNA或DNA中的單堿基突變的位置。在RNA:DNA或RNA:RNA雜交體中,若存在單堿基錯配,可用RNAse A識別并切割。通過凝膠電泳分析切割產物的大小,即可確定錯配的位囂。

③RNA檢測。RNA酶保護分析法(RNase protection assay)是近年來發展起來的一種檢測RNA的雜交技術。其基本原理是利用單鏈RNA探針,與待測的RNA樣品進行雜交形成RNA:RNA雙鏈分子,由于RNA酶可專一性地降解未雜交的單鏈RNA,而雙鏈受到保護不被降解,經凝膠電泳可以確定目的RNA的長度。該方法靈敏度較Northern雜交法更高,并可進行較為準確的定量。選擇適當的探針,還可進行基因轉錄起始位點分析及內含子(也稱內元)剪切位點分析等研究。此法的靈敏度比核酸酶S1保護分析法高數倍。

④降解DNA制備物中的RNA分子。須使用無DNAsd的RNase(DNase I free RNase),市售的一般RNase A常含有DNase,可在100 retool/I Tris—CI(pH 7.5)和15 mmol/l。NaCI溶液中100℃加熱15 min,以去除之。

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