細胞裂解液各成分的作用:
1、第一種50mmol/L Tris-HCl是緩沖液,保證細胞裂解時PH值也能穩定,Tris是一種有機堿。
2、第二種1.0 mmol/L EDTA是一種金屬螯合劑。
3、第三種150 mmol/L NaCl是等滲體系電解質,用于協調細胞膜內外離子平衡。
4、第四種0.1% SDS是十二烷基硫酸鈉,是一種表面活性劑和還原劑,有增溶作用。
細胞裂解液的制備:
一、試劑準備
1、新鮮配制冷的 RIPA 裂解緩沖液:
150 mM NaCL
1% NP-40 (去垢劑)
0.1% SDS (去垢劑)
2ug/ml Aprotinin (蛋白酶抑制劑) (使用前加入)
2ug/ml Leupeptin (蛋白酶抑制劑) (使用前加入)
1 mM PMSF (蛋白酶抑制劑)
1.5 mM EDTA (蛋白酶抑制劑)
1mM NaVanadate (磷酸脂酶抑制劑)(任選)
以上所有試劑均按比例溶于150 mM NaCL溶液中。
2、冷的PBS 中加入 1 mM PMSF
1.5 mM EDTA
1mM NaVanadate (釩酸鈉)(任選)
3、對數期生長狀態佳的細胞,75cm至少3-4瓶(90%以上生長面積)。
二、實驗步驟
1、將長滿細胞的培養瓶放置在冰上, 用吸液管吸出培養液。加入足夠的冷的 PBS在培養瓶中充分洗滌細胞表面,以洗去瓶中殘留的培養基,倒掉PBS ,重復以上操作2-3遍。在最后一次洗滌中盡可能吸干殘留的PBS,盡量在冰上操作。
2、向培養瓶中加入冷的RIPA 裂解緩沖液 (每75cm2 培養瓶加1ml). 然后用細胞刮子沿著瓶壁開始刮細胞,如果所需要刮的同種細胞有多瓶,則將第一瓶刮下的細胞液吸出轉入下一瓶中繼續刮 (由于處理后的細胞裂解液較粘稠,所以宜用直徑大點的吸液管吸取)。
3、吸出刮好的細胞裂解液置于14ml 離心管中 (置于冰上),然后重復步驟2以刮取剩下的細胞。
4、盡可能將多的細胞裂解液收集到14ml的離心管中,樣品插入冰盒進行超聲,超聲強度以不產生泡沫為準,超聲每次2-3秒,重復3-4次。如仍有細胞碎片或沉淀,應離心10000rpm,10分鐘,留取上清。
5、取出小量細胞裂解液測其蛋白濃度(用Biorad Bradford 試劑盒或紫外分光光度計,在A280測定),分裝保存在 -70℃。