實(shí)驗(yàn)概要

本實(shí)驗(yàn)介紹了微生物分離和純化的基本原理，旨在掌握常用的分離純化微生物的方法、菌落特征的觀察、微生物的幾種接種技術(shù)、建立無(wú)菌操作的概念及無(wú)菌操作的基本環(huán)節(jié)。

實(shí)驗(yàn)原理

從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過(guò)程稱為微生物分離與純化。平板分離法普遍用于微生物的分離與純化。其基本原理是選擇適合于待分離微生物的生長(zhǎng)條件，如營(yíng)養(yǎng)成分、酸堿度、溫度和氧等要求，或加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長(zhǎng)，而抑制其他微生物生長(zhǎng)的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物。

微生物在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形成的單個(gè)菌落，通常是由一個(gè)細(xì)胞繁殖而成的集合體。因此可通過(guò)挑取單菌落而獲得一種純培養(yǎng)。獲取單個(gè)菌落的方法可通過(guò)稀釋涂布平板或平板劃線等技術(shù)完成。值得指出的是，從微生物群體中經(jīng)分離生長(zhǎng)在平板上的單個(gè)菌落并不一定保證是純培養(yǎng)。因此，純培養(yǎng)的確定除觀察其菌落特征外，還要結(jié)合顯微鏡檢測(cè)個(gè)體形態(tài)特征后才能確定，有些微生物的純培養(yǎng)要經(jīng)過(guò)一系列分離與純化過(guò)程和多種特征鑒定才能得到。

土壤是微生物生活的大本營(yíng)，它所含微生物無(wú)論是數(shù)量還是種類都是極其豐富的。因此土壤是微生物多樣性的重要場(chǎng)所，是發(fā)掘微生物資源的重要基地，可以從中分離、純化得到許多有價(jià)值的菌株。本實(shí)驗(yàn)將采用不同的培養(yǎng)基從土壤中分離不同類型的微生物。

將微生物的培養(yǎng)物或含有微生物的樣品移植到培養(yǎng)基上的操作技術(shù)稱之為接種。接種是微生物實(shí)驗(yàn)及科學(xué)研究中的一項(xiàng)最基本的操作技術(shù)。無(wú)論微生物的分離、培養(yǎng)、純化或鑒定以及有關(guān)微生物的形態(tài)觀察及生理研究都必須進(jìn)行接種。接種的關(guān)鍵是要嚴(yán)格的進(jìn)行無(wú)菌操作，如操作不慎引起污染，則實(shí)驗(yàn)結(jié)果就不可信，影響下一步工作的進(jìn)行。

主要試劑

10%酚液，盛9ml無(wú)菌水的試管，盛90ml無(wú)菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶，4%水瓊脂。淀粉瓊脂培養(yǎng)基(高氏I號(hào)培養(yǎng)基)，牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基，查氏瓊脂培養(yǎng)基，活性污泥混合液。普通瓊脂斜面和平板，營(yíng)養(yǎng)肉湯，普通瓊脂高層(直立柱)。

主要設(shè)備

無(wú)菌玻璃涂棒，無(wú)菌吸管，接種環(huán)，無(wú)菌培養(yǎng)皿，鏈霉su和土樣，顯微鏡，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、涂布器等。酒精燈，玻璃鉛筆，火柴，試管架、接種環(huán)、接種針、接種鉤、滴管、移液管、三角型接種棒等接種工具。

實(shí)驗(yàn)材料

大腸桿菌、金黃se葡萄球菌。

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 稀釋涂布平板法

(1). 倒平板

將牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、高氏I號(hào)瓊脂培養(yǎng)基、馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基加熱溶化待冷至55～60℃時(shí)，高氏I號(hào)瓊脂培養(yǎng)基中加入10%酚數(shù)滴，馬丁氏培養(yǎng)中加入鏈霉su溶液(終濃度為30μg/ml)，混合均勻后分別倒平板，每種培養(yǎng)基倒三皿。

倒平板的方法：右手持盛培養(yǎng)基的試管或三角瓶置火焰旁邊，用左手將試管塞或瓶塞輕輕地?fù)艹觯嚬芑蚱靠诒３謱?duì)著火焰；然后左手拿培養(yǎng)皿并將皿蓋在火焰附近打開(kāi)一縫，迅速倒人培養(yǎng)基約15ml，加蓋后輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布在培養(yǎng)皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即為平板。

(2). 制備活性污泥混合液稀釋液

稱取土樣l0g，放入盛90ml無(wú)菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中，振搖約20min，使土樣與水充分混合，將細(xì)胞分散。用一支lml無(wú)菌吸管從中吸取1ml土壤懸液加入盛有9ml無(wú)菌水的大試管中充分混勻，然后用無(wú)菌吸管從此試管中吸取lml加入另一盛有9ml無(wú)菌水的試管中，混合均勻，以此類推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀釋度的活性污泥混合液溶液，注意：操作時(shí)管尖不能接觸液面，每一個(gè)稀釋度換一支試管。

(3). 涂布

將上述每種培養(yǎng)基的三個(gè)平板底面分別用記號(hào)筆寫(xiě)上10-4、10-5和10-6三種稀度，然后用無(wú)菌吸管分別由10-4、10-5和10-6，從三管活性污泥混合液稀釋液中各吸取0.1或0.2ml，小心地滴在對(duì)應(yīng)平板培養(yǎng)基表面中央位置。

用無(wú)菌玻璃涂棒，右手拿無(wú)菌涂棒平放在平板培養(yǎng)基表面上，將菌懸液先沿同心圓方向輕輕地向外擴(kuò)展，使之分布均勻。室溫下靜置5～l0min，使菌液浸入培養(yǎng)基。

(4). 培養(yǎng)

將高氏I號(hào)培養(yǎng)基平板和馬丁氏培養(yǎng)基平板倒置于28℃溫室中培養(yǎng)3～5d，肉膏蛋白胨平板倒置于37℃溫室中培養(yǎng)2～3d。

(5). 觀察并挑菌落

將培養(yǎng)后長(zhǎng)出的單個(gè)菌落根據(jù)其大小、顏色、形狀等特征進(jìn)行觀察，之后根據(jù)菌落不同特征分別挑取少許細(xì)胞接種到上述三種培養(yǎng)基斜面上，分別置28℃和37℃溫室培養(yǎng)。若發(fā)現(xiàn)有雜菌，需再一次進(jìn)行分離、純化，直到獲得純培養(yǎng)。

2. 平板劃線分離法

(1). 倒平板

按稀釋涂布平板法倒平板，并用記號(hào)筆標(biāo)明培養(yǎng)基名稱、土樣編號(hào)和實(shí)驗(yàn)日期。

(2). 劃線

在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環(huán)，挑取上述10-l的活性污泥混合液懸液一環(huán)在平板上劃線。劃線的方法很多，但無(wú)論采用哪種方法，其目的都是通過(guò)劃線將樣品在平板上進(jìn)行稀釋，使之形成單個(gè)菌落。

用接種環(huán)以無(wú)菌操作挑取活性污泥混合液懸液一環(huán)，先在平板培養(yǎng)基的一邊作第一次平行劃線3～4條，再轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約70度角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過(guò)第一次劃線部分作第二次平行劃線，再用同樣的方法通過(guò)第二次劃線部分作第三次劃線和通過(guò)第三次平行劃線部分作第四次平行劃線。劃線完畢后，蓋上培養(yǎng)皿蓋，倒置于溫室培養(yǎng)。

(3). 挑菌落

同稀釋涂布平板法，一直到分離的微生物認(rèn)為純化為止。

3. 常用四種接種方法操作指導(dǎo)：

(1).   斜面接種法：斜面接種法主要用于接種純菌，使其增殖后用以鑒定或保存菌種。通常先從平板培養(yǎng)基上挑取分離的單個(gè)菌落，或挑取斜面，肉湯中的純培養(yǎng)物接種到斜面培養(yǎng)基上。操作應(yīng)在無(wú)菌室、接種柜或超凈工作臺(tái)上進(jìn)行，先點(diǎn)燃酒精燈。將菌種斜面培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱菌種管)與待接種的新鮮斜面培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱接種管)持在左手拇指、食指、中指及無(wú)名指之間，菌種管在前，接種管在后，斜面向上管口對(duì)齊，應(yīng)斜持試管呈45～50度角，并能清楚地看到兩個(gè)試管的斜面，注意不要持成水平，以免管底凝集水浸濕培養(yǎng)基表面。以右手在火焰旁轉(zhuǎn)動(dòng)兩管棉塞，使其松動(dòng)，以便接種時(shí)易于取出。右手持接種環(huán)柄，將接種環(huán)垂直放在火焰上灼燒。鎳鉻絲部分（環(huán)和絲）必須燒紅，以達(dá)到滅菌目的，然后將除手柄部分的金屬桿全用火焰灼燒一遍，尤其是接鎳鉻絲的螺口部分，要徹di灼燒以免滅菌不徹di。用右手的小指和手掌之間及無(wú)名指和小指之間撥出試管棉塞，將試管口在火焰上通過(guò)，以殺滅可能沾污的微生物。棉塞應(yīng)始終夾在手中如掉落應(yīng)更換無(wú)菌棉塞。將灼燒滅菌的接種環(huán)插入菌種管內(nèi)，先接觸無(wú)菌苔生長(zhǎng)的培養(yǎng)基上，待冷卻后再?gòu)男泵嫔瞎稳∩僭S菌苔取出，接種環(huán)不能通過(guò)火焰，應(yīng)在火焰旁迅速插入接種管。在試管中由下往上做S形劃線。接種完畢，接種環(huán)應(yīng)通過(guò)火焰抽出管口，并迅速塞上棉塞。再重新仔細(xì)灼燒接種環(huán)后，放回原處，并塞緊棉塞。將接種管貼好標(biāo)簽或用玻璃鉛筆劃好標(biāo)記后再放入試管架，即可進(jìn)行培養(yǎng)。

(2).   液體接種法：多用于增菌液進(jìn)行增菌培養(yǎng)，也可用純培養(yǎng)菌接種液體培養(yǎng)基進(jìn)行生化試驗(yàn)，其操作方法與注意事項(xiàng)與斜面接種法基本相同，僅將不同點(diǎn)介紹如下：由斜面培養(yǎng)物接種至液體培養(yǎng)基：用接種環(huán)從斜面上沾取少許菌苔，接至液體培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)在管內(nèi)近液面試管壁上將菌苔輕輕研磨并輕輕振蕩，或?qū)⒔臃N環(huán)在液體內(nèi)振搖幾次即可。如接種霉菌菌種時(shí)，若用接種環(huán)不易挑起培養(yǎng)物時(shí)，可用接種鉤或接種鏟進(jìn)行。由液體培養(yǎng)物接種液體培養(yǎng)基時(shí)，可用接種環(huán)或接種針沾取少許液體移至新液體培養(yǎng)基即可。也可根據(jù)需要用吸管、滴管或注射器吸取培養(yǎng)液移至新液體培養(yǎng)基即可。接種液體培養(yǎng)物時(shí)應(yīng)特別注意勿使菌液濺在工作臺(tái)上或其他器皿上，以免造成污染。如有濺污，可用酒精棉球灼燒滅菌后，再用消毒液擦凈。凡吸過(guò)菌液的吸管或滴管，應(yīng)立即放入盛有消毒液的容器內(nèi)。

(3).  固體接種法：普通斜面和平板接種均屬于固體接種，斜面接種法已講了，不再贅述。固體接種的另一種形式是接種固體曲料，進(jìn)行固體發(fā)酵。按所用菌種或種子菌來(lái)源不同可分為：用菌液接種固體料，包括用菌苔刮洗制成的菌懸液和直接培養(yǎng)的種子發(fā)酵液。接種時(shí)按無(wú)菌操作將菌液直接倒入固體料中，攪拌均勻。但要注意接種所用水容量要計(jì)算在固體料總加水量之內(nèi)，否則會(huì)使接種后含水量加大，影響培養(yǎng)效果。用固體種子接種固體料。包括用孢子粉、菌絲孢子混合種子菌或其他固體培養(yǎng)的種子菌。將種子菌于無(wú)菌條件下直接倒入無(wú)菌的固體料中即可，但必須充分?jǐn)嚢枋怪旌暇鶆颉Ｒ话闶窍劝逊N子菌和少部分固體料混勻后再拌大堆料。

(4).  穿刺接種法：此法多用于半固體、醋酸鉛、三糖鐵瓊脂與明膠培養(yǎng)基的接種，操作方法與注意事項(xiàng)與斜面接種法基本相同。但必須使用筆直的接種針，而不能使用接種環(huán)。接種柱狀高層或半高層斜面培養(yǎng)管時(shí)，應(yīng)向培養(yǎng)基中心穿刺，一直插到接近管底，再沿原路抽出接種針。注意勿使接種針在培養(yǎng)基內(nèi)左右移動(dòng)，以使穿刺線整齊，便于觀察生長(zhǎng)結(jié)果。