1.目的
學會用限制性內切酶切割質粒DNA。
2.原理
II型限制性內切酶能識別雙鏈DNA內部的特殊序列并在識別位點處將雙鏈切斷,形成粘性末端或齊平末端,通過電泳酶切后的DNA混合物能夠確認和分離酶切片段。
3.器材
旋渦混合器,微量移液取樣器,移液器吸頭,1.5ml微量離心管,雙面微量離心管架,水漂,恒溫水浴。
4.試劑
Pinpoint?xa-3質粒,EcoR V,BamH I,內切酶緩沖液(10×),10×電泳加樣緩沖液,熒光染料。
5.實驗準備
配制TAE電泳緩沖液(50?儲存液),10?加樣緩沖液,1.5ml離心管裝入鋁制飯盒(滅菌)、移液器吸頭裝入相應的吸頭盒(滅菌)。
6.操作步驟
(1)混合下列溶液于一個無菌的1.5ml微量離心管中:
Pinpoint?xa-3 DNA (或pUCm-T-CHI ) 6 μl
10×酶切緩沖液(用EcoRV的緩沖液) 2 μl
ddH2O 30 μl
EcoRV 1μl
BamHI 1μl
總體積 40μl
(2)先準備一個冰盒并放入一定量的冰塊。從-20℃冰柜中取出限制性內切酶,立即插入冰塊中。
(3)用一只手的手指捏在盛放酶的微量離心管的上部(以免手指的給酶液加溫),另一只手持微量移液器,小心翼翼地吸取1 μl限制性內切酶。
(4)在酶切樣品混合液中加入限制性內切酶后(立即把內切酶原液送回冰柜!),輕輕震動微量離心管使管中的溶液混勻。再在離心機中1000rpm離心10秒。取出后插到水漂的孔中,在推薦的最適酶切溫度水浴中溫育1~3 h(一般是 37℃)。
(5)酶切后取少量酶切產物與合適的已知分子量的DNA(如先前的PCR產物)對比電泳,以確認切下的片斷是否為自己想要的片斷。
(6)酶切后的質??梢曰厥諅溆茫ㄒ妼嶒灹簭沫傊悄z中回收DNA片段)。
(7)清理桌面垃圾,清洗實驗儀器。撰寫實驗報告。