一.蛋白樣品制備
之前和大家介紹過細胞和組織蛋白質(zhì)的提取,當我們做WB的時候,需要對提取好的蛋白樣品進行處理:在蛋白樣品中加入SDS loading buffer 6X(蛋白上樣緩沖液)稀釋至1X(如蛋白樣品有120ul,則加入SDS loading buffer 6X 600ul),混勻,75-95度加熱10-15分鐘,使蛋白變性以充分暴露抗原位點。在加熱結(jié)束后,進行離心,使蛋白樣品適當降溫,防止PAGE膠被融化。
蛋白上樣緩沖液
PS:要測量的蛋白如果是磷酸化形式,一般加熱到75度,一般情況可95度加熱。市面上買到的SDS loading buffer 有2X的也有5X的,最后稀釋至1X即可。
那么為什么我們加入SDS loading buffer呢?主要就是用它的不同成分在電泳中起了關(guān)鍵的作用。
SDS loading buffer 的主要成分及作用:A:0.1%溴酚藍,作為指示劑,方便觀察電泳進行的程度;B:10%甘油,密度大,增加樣本的重量,可攜帶樣本沉到底部;C:2%SDS,是一種陰離子表面活性劑,能打斷蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵,按一定比例和蛋白質(zhì)分子結(jié)合成為復合物,是蛋白質(zhì)帶滿負電荷,從而是蛋白帶電荷一致,減少電荷對電泳結(jié)果的影響;D:巰基乙醇還原劑,使蛋白質(zhì)的二硫鍵斷開,使得蛋白保持線性結(jié)構(gòu)。
蛋白上樣
1. 將之前配好的膠固定在電泳裝置上,加入1X電泳液。
2. 拔出梳子,應(yīng)該兩側(cè)同時用力,緩慢拔出,注意在拔除梳子時防止氣泡進入梳孔使其變形,若上樣孔有變形,可用適當粗細的針頭撥正。
3.加入蛋白樣品,一般10孔的梳孔,每孔可以加入20ul -40ul蛋白樣品,15孔的梳孔,每孔可以加入10ul -30ul蛋白樣品,是用微量注射器加樣,平時我們也可以用普通的移液槍加樣,盡量讓槍頭深入梳孔底物,防止蛋白樣品飄出,一般在目的蛋白兩側(cè)加入等量的marker,如果兩側(cè)有空的梳孔,應(yīng)該加入1X的loading buffer,起“壓邊"作用,可以使蛋白樣品在一條水平線上往下跑。
4.電泳:接上電極,正負極不要弄反,紅色對紅色,黑色對黑色,初始電壓設(shè)為90V,當樣品跑至分離膠時將電壓調(diào)至120V,一般在溴酚藍跑出膠時停止電泳,也可根據(jù)目的蛋白的分子量來選擇跑的時間,如分子量較大,可以延長電泳時間,使得分子量大的marker跑的分散開,容易判斷分子量。
注意事項
1.蛋白樣品上樣量最好相等,不要過多。
2.不要過多重復使用電泳Buffer
3.最佳分辨區(qū)在分離膠的2/3
4.電泳后測定的分子量有10%的誤差,不可wan全信任。有些蛋白質(zhì)由亞基(如血紅蛋白)或兩條以上的肽鏈(α-胰凝ru蛋白酶)組成的,它們在巰基乙醇和SDS的作用下解離成亞基或多條單肽鏈,SDS-PAGE電泳法測定的只是它們的亞基或是單條肽鏈的相對分子量,有的蛋白質(zhì)(如電荷異常或結(jié)構(gòu)異常的蛋白質(zhì),帶有較大輔基的蛋白質(zhì))不能采用該發(fā)測相對分子量。
5.如果電泳中出現(xiàn)拖尾,染色帶的背景不清晰等現(xiàn)象,可能是SDS不純引起。