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上海遠慕生物科技有限公司

RNA酶保護試驗詳細介紹
點擊次數:411 更新時間:2022-12-26

  RNA酶保護法是一種全新的mRNA定量分析方法。其基本原理是將標記的特異RNA探針(32P或生物su)與待測的RNA樣品液相雜交,標記的特異RNA探針按堿基互補的原則與目的基因特異性結合,形成雙鏈RNA;未結合的單鏈RNA經RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸,而待測目的基因與特異RNA探針結合后形成雙鏈RNA,免受RNA酶的消化,故該方法命名為RNA酶保護實驗。

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  目錄


  · 一、 RNA酶保護試驗的介紹


  · 二、試劑準備


  · 三、操作步驟


  · 四、電泳與放射自顯影


  · 五、注意事項


  RNA酶保護試驗是通過液相雜交的方式,用反義RNA探針與樣品雜交,以檢測RNA表達的技術。


  一、 RNA酶保護試驗的介紹


  RNA酶保護試驗(RNase Protection Assay,RPA) 是通過液相雜交的方式,用反義RNA探針與樣品雜交,以檢測RNA表達的技術。與Northern blot和RT-PCR比較,RPA有以下幾個優點:


  1. 檢測靈敏度比Northern雜交高。由于Northern雜交步驟中轉膜和洗膜都將造成樣品和探針的損失,使靈敏度下降,而RPA將所有雜交體系進行電泳,故損失小,提高了靈敏度。


  2. 由于PCR擴增過程中效率不均一和反應“平臺"問題,基于PCR產物量進行分析所得數據的可靠性將下降,而RPA沒有擴增過程,因此,分析的數據真實性較高。


  3.由于與反義RNA探針雜交的樣品RNA僅為該RNA分子的部分片段,因此,部分降解的RNA樣品仍可進行分析。


  4.步驟較少,耗時短。與Northern雜交相比,省去了轉膜和洗膜的過程。


  5. RNA-RNA雜交體穩定性高,無探針自身復性問題,無須封閉。


  6. 一個雜交體系中可同時進行多個探針雜交,無競爭性問題。


  7. 檢測分子長度可以任意設置,靈活性大。


  RPA的缺點是需要同位素標記探針。


  二、試劑準備


  1. GACU POOL:取100mM ATP.CTP.GTP各2.78μl.100mM UTP 0.06μl,加DEPC H2O至100μl。


  2. 雜交緩沖液:PIPES 0.134g.0.5M EDTA(pH8.0) 20μl.5M NaCl 0.8ml.甲酰胺8ml,加DEPC H2O至10ml。


  3. RNase消化液:5M NaCl 120μl.1M Tris-HCl(pH7.4) 20μl.0.5M EDTA(pH8.0) 20μl.RNase A(10mg/ml) 8μl.RNase T1(250U/μl) 1μl,加DEPC H2O至2ml


  三、操作步驟


 ?。ㄒ唬?反義RNA制備


  可由含T7或SP6啟動子的重組質粒為模板制備,也可以用含啟動子的PCR產物為模板制備,本文介紹后者。


  1.設計含T7啟動子的PCR引物


  由于PCR產物將作為合成反義RNA的模板,所以一對引物中的下游引物5’-端要含T7啟動子序列: T7啟動子序列為:5’-TAATACGACTCACTATAGGG


  引物設計的其他要求與一般PCR引物的設計相同。PCR產物的長度決定了反義RNA探針的長度,具體設計時可考慮100-400bp長。最好采用巢式PCR,即先擴增出一較長的片段,再以該片段為模板擴增出較短的片段,以保證探針的特異性,


  2.PCR 先用上游引物和下游引物Ⅰ進行PCR,再以PCR 產物為模板,用上游引物和下游引物Ⅱ-T7進行二次PCR。


  3.探針合成標記與純化


  在0.5ml 離心管中加入下列試劑:

  RNasin (40U/μl) 0.5μl

  GACU POOL GAC

 ?。ê珿TP.CTP.ATP各2.75 mM,UTP 61μM) 2μl

  [α-32P]UTP(10μCi/μl) 2.5μl

  DTT (二硫蘇糖醇,0.1M) 1μl

  5×轉錄 buffer 2μl

  模板(50ng/μl) 1μl

  T7 RNA 聚合酶 (15U) 1μl

  混合后,短暫離心,37℃保溫1hr。

  加入DNaseⅠ(10U/μl) 1μl, 37℃ 15min, 然后75 ℃ 10min以滅活DNAseⅠ和T7 RNA 聚合酶。

  加入:飽和酚 50μl

  氯仿 50μl

  酵母tRNA(2μg/μl) 4μl

  DEPC H2O 100μl


  室溫下充分混勻,離心10000g×2min。取上層液置另一0 .5ml離心管中,加入100μl氯仿,混勻,離心10000g×2min。將上層液轉移至另一0.5ml 離心管中,再加入3M NaAc 10μl,預冷無水乙醇250μl,混勻后,-20℃靜置30min。4℃離心13500g×10min。棄上清液,沉淀用75%乙醇100μl洗滌,4℃離心13500g×2min, 棄上清液。室溫下揮發殘留乙醇。加入50μl雜交緩沖液溶解沉淀,4℃下保存待用。可用尿素-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測探針質量。


 ?。ǘ?雜交


  1.RNA提取后溶解在雜交緩沖液中,濃度為1μg/μl。


  2.取8μl RNA加入1-3μl探針(根據探針檢測結果調整) 于0.5ml 離心管中。


  3.80℃保溫2min,然后40-45℃下雜交12-18hr。


 ?。ㄈ?消化


  1.雜交管于37 ℃保溫15min,加入RNase消化液,37 ℃保溫30min。


  2.加入10%SDS 10μl.10μg/μl蛋白酶K 20μl,混勻,37 ℃保溫10min。


  3.加入65μl飽和酚和65μl氯仿,混勻,室溫離心,10000g×2min。


  4.轉移上層液到另一0.5離心管中,加入10μl酵母tRNA和3M NaAc 15μl,再加入200μl異丙醇,混勻后,置-20℃ 30min,4 ℃離心,135000g×10min。


  5.棄上清液,室溫下揮發乙醇,加入5-8μl上樣緩沖液溶解沉淀。


  四、電泳與放射自顯影


 ?。ㄒ唬?配制凝膠:(50ml)

  40%丙烯酰胺-亞甲雙丙烯酰胺(19:1) 6.25ml

  5×TBE 10ml

  尿素 24g

  加H2O至50ml

  溶解后加入25%過硫酸胺50μl,TEMED 50μl,混勻,注入電泳槽中,插入梳,待膠凝固。


  (二) 預電泳(50ml)

  以1×TBE為上下槽電泳緩沖液,加上電壓后進行預電泳,如果用測序電泳裝置,電壓應達2000v以上,功率設定為100w,溫度設為50 ℃。待膠板溫度達50 ℃時,暫停電泳,準備加樣。


 ?。ㄈ?加樣

  將已溶解在加樣緩沖液中的樣品80 ℃加熱2min,立即加樣到膠孔中,電泳1-2hr。(電泳條件同預電泳) 。


  (四) 電泳結束

  電泳結束后,打開膠板,用濾紙取下膠,覆上一層保鮮膜,放置于暗盒中,暗室紅光下,壓上一張X片,蓋上暗盒,-70℃曝光1-3天。暴光結束后,將X光片顯影.定影.水洗.晾干。


  五、注意事項


  1.本實驗大部分為RNA操作,注意RNA酶的污染。


  2.RNase消化液消化未雜交的單鏈RNA和探針RNA,當探針與樣品之間有堿基錯配時,錯配位點也將被消化,因此會產生片段較小的雜交片段。因此進行PCR時,采取盡量減少錯配的措施。


  3.同位素對RNA合成有一定影響,有時會產生非全長的探針。因此,標記時間不宜過長。


  4.RNase消化液有時會產生過度消化而無檢測信號,可以將消化液稀釋10-100倍后使用。


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