蛋白質的制備是一項十分細致的工作。涉及物理學、化學和生物學的知識很廣。高分子蛋白質具有一定的立體構象,相當不穩定,極易變性、變構,為得到天然狀態的蛋白質,盡量采用溫和的手段,如中性、低溫、避免起泡等,還要注意防腐。
動物材料中的蛋白質有些可溶的形式存在于體液(如血漿、消化硫等)中,可以不必經過提取直接進行分離。蛋白質中的角蛋白、膠原及絲蛋白等不溶性蛋白質,只需要適當的溶劑洗去可溶性的伴隨物,如脂類、糖類以及其他可溶性蛋白質,最后剩下的就是不溶性蛋白質。這些蛋白質經細胞破碎后,用水、xi鹽酸及緩沖液等適當溶劑,將蛋白質溶解出來,再用離心法除去不溶物,即得粗提取液。
整個制備過程一般可分為5 個階段:①材料的選擇和預處理,②細胞的破碎(有時需進行細胞器的分離),③提取,④純化(包括鹽析,有機溶劑沉淀,有機溶劑提取、吸附、層析、超離心及結晶等),⑤濃縮、干燥及保存。以上5 個階段不是要求每個方案都完整地具備,也不是每一階段截然分開。
不論是哪一階段使用哪一種方法,均必須在操作中保持生物大分子結構的完整性。保存活性,防止變性及降解現象的發生。因空間結構主要依靠氫鍵、鹽鍵和范德華力的存在,遇酸、遇堿、高溫、劇烈的機械作用及強烈的輻射等均可導致活性喪失。
細胞破碎方法有多種,比如機械法(如組織搗碎勻漿機、玻璃勻漿器)、物理法(反復凍融法、冷熱交替法、超聲波法、高壓破碎),化學及生物化學法(加入有機溶劑、溶解酶或裂解酶、表面活性劑)等。
高壓細胞破碎法是一種物理破碎方法,避免了化學法和酶法等導致的化學物殘留和污染等問題。超聲破碎法可能出現的起泡現象在高壓破碎時是不會出現的。
樣品經適當預處理,再配合使用低溫超高壓連續流細胞破碎儀,提取到的蛋白質活性好。(參考文獻:氯氟氰菊酯對德國小蠊保護酶活性的影響,中國媒介生物學及控制雜志,2009,20(4):303-306)。這是因為在細胞破碎過程中,低溫超高壓連續流細胞破碎儀提供周密的保護,最大限度地保持蛋白質活性,具體表現在:
①du創的沖洗系統及進口鏡面拋光316L不銹鋼管道,防止樣品殘留,保證管道清潔,排除酸堿干擾。 316L不銹鋼拋光管道316L不銹鋼管道
②進樣、破碎、出樣全過程可在4~6℃低溫循環水浴中進行,避免高溫導致的蛋白質失活。
③破碎壓力0~207Mpa連續可調,便于摸索最佳破碎條件,保證溫和破碎。