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上海遠慕生物科技有限公司

免疫球蛋白提取分離純化技術
點擊次數:312 更新時間:2022-12-15

實驗概要

免疫球蛋白(Immunoglobulin Ig)的含量代表著機體體液免疫的水平,并進一步代表著B細胞的功能,因此測定血清Ig含量可以推知機體的體液免疫功能和診斷某些疾病引起的Ig的過高和過低。本實驗對禽血清IgG和IgA進行了分離純化。

實驗原理

免疫球蛋白包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。隨著免疫學的發展和需要,免疫球蛋白的純化和其成分的提純成為bi不可少的手段。純化的方法很多,有單一法,但大多數采用二步法以上相結合的方法,特別是以硫酸銨提純為基礎,再經過層析柱的方法來提高免疫球蛋白及其各成分的純度最為常用。

硫酸銨溶液能使蛋白質膠體脫水并中和其電荷而使之沉淀下來(稱為鹽析)。不同濃度的硫酸銨鹽析蛋白成分不同,利用這一原理提取所需的免疫球蛋白成分。鹽析只能粗提,為了獲得純化的免疫球蛋白成分,必須進一步采用層析的方法進行分離。

主要試劑

1. 禽血清IgG的分離與提純(Na2SO4法)
1) 5%葡聚糖硫酸鹽
2) 0.02Mol/L MnCl2溶液
3) 無shui硫酸鈉
4) pH8.2硼酸鹽緩沖液
5) 0.06Mol/L pH7.4PB液

2. 禽IgA提取與純化
1) 禽膽汁
2) 飽和硫酸銨溶液
3) 0.01Mol/L pH7.4PBS液
4) 0.10Mol/L pH6.4PBS液(0.30Mol/L NaCl)
5) DEAE52-纖維素

實驗步驟

1. 禽血清IgG的分離與提純(Na2SO4法)

1) 取禽血清10ml加5%葡聚糖硫酸鹽液,0.40ml和0.025Mol/L MnCl21.00ml充分混合,靜置,然后離心去沉淀,此步目的是為了去掉脂類物質。
2) 于上清液中加無shui硫酸鈉使每毫升血清含0.18g,緩慢加入,混勻,靜置30min,3 000r/min離心去上清。
3) 以pH8.2硼酸鹽緩沖液將沉淀稀釋至原血清的一半再加硫酸鈉使成0.16g/ml,同上法離心去上清。
4) 重復步驟3,加Na2SO4,使成0.14g/ml。
5) 以少量硼酸鹽緩沖液溶解沉淀,然后裝透析袋除鹽48h。
6) 過SephadexG200柱,收集第一峰和第二峰。第一峰是IgM,第二峰主要是IgG。
7) 如要進一步提純,則用第二峰再過DEAE—纖維素柱,以0.06Mol/L pH7.4 PB液洗脫,洗脫下來的蛋白液即為IgG。
也可以按以下操作方法進行:
1) 以18%硫酸鈉(W/V)提取一次,再以14%的硫酸鈉提取一次。
2) 將粗提的免疫球蛋白以PBS溶解,按9%加入無shui硫酸鈉,離心。再將上清按5%加入無水liu酸鈉,離心。將兩沉淀溶解、混合,在常水中透析過夜,再在生理鹽水中4℃透析,直至無SO42-為止。
3) 離心將上清液以pH8.0 0.20Mol/L PBS液平衡。
4) 過SephadexG200柱,以pH8.0 0.20Mol/L PBS液洗脫,收集洗脫液,取第二峰即為雞IgG。

2. 禽IgA提取與純化
1) 取冷藏的膽汁3ml,緩慢滴加1ml飽和硫酸銨液,邊加邊攪拌,使成25%飽和硫酸銨液。4℃放置30min。
2) 3000r/min離心30min,去沉淀。
3) 取上清,加飽和硫酸銨液,使成35%的飽和度,4℃放置30min。
4) 3000r/min離心30min,棄上清。
5) 取沉淀,加0.85%NaCl液溶解,加飽和硫酸銨溶液,重復步驟3和4三次。
6) 將沉淀用0.85%NaCl液溶解,裝入透析袋,以0.01Mol/L pH7.4PBS液透析。
7) 以0.01Mol/L pH7.4PBS液平衡,過DEAE52纖維柱(20×250mm)。
8) 取透析樣品4ml(﹥20mg/ml蛋白濃度)加入層析柱。以0.01Mol/L pH7.4PBS液洗脫。
9) 再用0.10Mol/L pH6.4PBS液(NaCl濃度為0.30Mol/L)洗脫,收集洗脫液。
10) 濃縮洗脫蛋白液至20mg/ml,分裝,低溫冰箱保存。


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