由于在流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)過程中,熒光抗體對單細(xì)胞懸液的標(biāo)記效果直接影響實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)質(zhì)量。因此,需要考慮各種影響流式抗體品質(zhì)及檢測效果的因素,例如抗體特異性、熒光素信號強(qiáng)弱、熒光素標(biāo)記方式、同型對照等。
流式抗體的選擇:
1. 流式抗體本身也是抗體,所以選擇流式抗體一定要滿足抗體選擇最基本的條件:目標(biāo)蛋白特異性,反應(yīng)種屬以及應(yīng)用實(shí)驗(yàn)。
2. 流式抗體熒光標(biāo)記的方式包括直接標(biāo)記和間接標(biāo)記兩種。在流式實(shí)驗(yàn)過程中,盡量減少實(shí)驗(yàn)工序和過程,以保證實(shí)驗(yàn)的真實(shí)和準(zhǔn)確性。因此在條件允許的范圍內(nèi),建議盡量用直接標(biāo)記的抗體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)而不去做間接標(biāo)記。
3. 流式抗體熒光標(biāo)記的選擇:如果實(shí)驗(yàn)中檢測單一指標(biāo):不同熒光標(biāo)記在不同的儀器上強(qiáng)度不同。FACS Calibur儀器為例:PE >APC >PE-Cy5 >PerCP >FITC >PerCP-Cy5.5,通常來說,PE最/強(qiáng),適用于弱表達(dá)抗原。FITC強(qiáng)度較弱,適用于強(qiáng)表達(dá)抗原,使用范圍比較廣。
用戶需根據(jù)檢測的目標(biāo)蛋白進(jìn)行具體選擇。如果同時(shí)檢測多個(gè)指標(biāo):確認(rèn)流式細(xì)胞儀能檢測多少個(gè)通道:流式抗體每個(gè)通道只能選擇1種熒光素。各個(gè)通道之間的熒光素可以隨意搭配。
如:實(shí)驗(yàn)者同時(shí)檢測三個(gè)指標(biāo),可以在圖1中綠色、黃色和紅色三個(gè)通道中各選一個(gè)適當(dāng)?shù)臒晒馑貥?biāo)記,F(xiàn)ITC、PE和PE-cy5。切忌所有指標(biāo)選擇同一個(gè)通道的熒光標(biāo)記,以防止熒光的重疊和相互干擾,影響最后結(jié)果。因此,流式細(xì)胞儀的通道越多,同一份樣本能同時(shí)做的表面/胞內(nèi)標(biāo)志就越多。常用熒光標(biāo)記包括FITC, PE, PEcy5, PEcy5.5, APC等。
同型對照的選擇:
流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和其他抗體相關(guān)實(shí)驗(yàn)有點(diǎn)不同的就是需要選擇同型對照。同型對照,是用于消除由于抗體非特異性結(jié)合到細(xì)胞表面而產(chǎn)生的背景染色,相當(dāng)于實(shí)驗(yàn)的陰性對照。同型對照選擇與標(biāo)記抗體同種屬來源,同亞型,同熒光標(biāo)記的抗體。比如:抗人的CD3的PE標(biāo)記的抗體,小鼠的IgG2a。同型對照選擇PE標(biāo)記的小鼠的IgG2a。
流式抗體使用注意事項(xiàng):
1. 建議實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的數(shù)量和抗體的比例要適當(dāng)。細(xì)胞過量或抗體過量都可能使實(shí)驗(yàn)結(jié)果受影響,因此需要優(yōu)化試驗(yàn)條件。注:不同的流式技術(shù)對抗體的需求量有較大差異,例如傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)(采用鞘液流系統(tǒng))需要1×106個(gè)細(xì)胞為起始上樣量,抗體用量為10 μl,而微流式細(xì)胞術(shù)則只需5×105個(gè)細(xì)胞,抗體用量減少到5 μl。
2. 直標(biāo)的流式抗體應(yīng)該4 ℃避光保存,不要冷凍。
3. 盡量選擇經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的流式抗體,以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。默克密理博公司Milli-Mark系列流式抗體已經(jīng)通過了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,并且提供了相關(guān)數(shù)據(jù)圖供用戶參考。
相關(guān)參考:
流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry,F(xiàn)CM): 是一種對液流中排成單列的細(xì)胞或其它生物微粒(如微球,細(xì)菌,小型模式生物等)逐個(gè)進(jìn)行快速定量分析和分選的技術(shù)。流式細(xì)胞術(shù)產(chǎn)生于上世紀(jì)六七十年代,具 有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn),是非常先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)。
該技術(shù)被廣泛的應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、血液學(xué)、腫瘤學(xué)、藥理學(xué)、遺傳學(xué)及臨床檢驗(yàn) 等多個(gè)領(lǐng)域,如細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞活力的檢測,淋巴細(xì)胞亞群與疾病的關(guān)系研究,器官/移植后的免疫學(xué)監(jiān)測,腫瘤的特異性指標(biāo)的檢測,藥物作用機(jī)制研 究,篩選新藥等等。