細胞周期流式檢測步驟詳解
點擊次數：410 更新時間：2022-05-27
材料與試劑：
PBS
乙醇，70-80%,提前放置-20°C預冷 固定劑
BD Pharmingen™stain buffer, or equivalent, 1X PBS, 2% FBS, 0.1% NaN3 (pH 7.1–7.4) 染色液
BD Pharmingen™PI/RNase staining buffer (for PI/Rnasestaining) PI/RNase染色液
BD Pharmingen™7-AAD (7-Amino-Actinomycin D) staining solution (for 7-AAD staining) 7-AAD染色液
使用說明：
DNA染料，尤其是PI，具有較強的粘性。樣本上機檢測之后，應遵照儀器說明書仔細清洗流式細胞儀，以免對下一位操作者結果造成影響 。固定好的細胞可保存長達12個月 (儲存于70-80% 的乙醇，置于 -20°C保存).
操作步驟：
1. 收獲細胞于流式管中，加入3-4ml的PBS清洗細胞。
2. 1000rpm離心10分鐘，棄上清。
3. 逐滴加入5ml或更多預冷的70-80%的乙醇，渦旋混勻細胞， 4°C避光過夜（>18小時）。
4. 1000-1500rpm 離心細胞10分鐘，棄上清。之后清洗細胞2次以去除所有的乙醇。
注：第一次用1x PBS，第二次用染色液
5. 細胞染色：每管樣本需10^6細胞。具體操作如下：
1) 對于PI/RNase 染色，將細胞重懸于0.5 mL PI/RNase 染色液.
2) 對于7-AAD染色，將細胞重懸于0.1 mL 染色液,同時加入20 μL7-AAD染色液.
6. 室溫避光孵育15分鐘。
7. 分析前4℃避光保存樣本。1小時之內上流式細胞儀檢測。
樣本制備注意事項：
1.獲得單個細胞，盡量避免DNA的降解
2.樣本最關鍵的就是減少碎片（EDTA/不可過度吹打/離心rpm）
3.PI既能與DNA結合，又能與RNA結合，所以要用RNase降解
4.PI質量及RNase所加量很重要，建議用商品化試劑
5.污染脫氧核糖核酸酶會降解DNA，故玻璃器皿和試劑要干凈滅菌
樣本檢測注意事項：
1.進樣速度：一般檢測細胞濃度調整為2E5–2E6/ml，進樣速度為低速。若峰形較寬，可能就是進樣速度太快
2.儀器質控定期做，盡可能排除因機器設置引起的峰形加寬
3.排除粘連細胞（FL2-A/FL2-W）
4.通過電壓脈沖信號的寬度和面積區別實體組織標本中的粘連細胞群體，最大/程度的減少粘連細胞帶來的假陽性結果
