菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)是發(fā)酵生產(chǎn)的第一道工序，該工序又稱之為種子制備。種子制備不僅要使菌體數(shù)量增加，更重要的是，經(jīng)過種子制備培養(yǎng)出具有高質(zhì)量的生產(chǎn)種子供發(fā)酵生產(chǎn)使用。因此，如何提供發(fā)酵產(chǎn)量高、生產(chǎn)性能穩(wěn)定、數(shù)量足夠而且不被其他雜菌污染的生產(chǎn)菌種，是種子制備工藝的關(guān)鍵。
 

　　種子擴(kuò)大培養(yǎng)的任務(wù)
 

　　工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模越大，每次發(fā)酵所需的種子就越多。要使小小的微生物在幾十小時的較短時間內(nèi)，完成如此巨大的發(fā)酵轉(zhuǎn)化任務(wù)，那就必須具備數(shù)量巨大的微生物細(xì)胞才行。菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的目的就是要為每次發(fā)酵罐的投料提供相當(dāng)數(shù)量的代謝旺盛的種子。因?yàn)榘l(fā)酵時間的長短和接種量的大小有關(guān)，接種量大，發(fā)酵時間則短。將較多數(shù)量的成熟菌體接入發(fā)酵罐中，就有利于縮短發(fā)酵時間，提高發(fā)酵罐的利用率，并且也有利于減少染菌的機(jī)會。因此，種子擴(kuò)大培養(yǎng)的任務(wù)，不但要得到純而壯的菌體，而且還要獲得活力旺盛的、接種數(shù)量足夠的菌體。對于不同產(chǎn)品的發(fā)酵過程來說，必須根據(jù)菌種生長繁殖速度快慢決定種子擴(kuò)大培養(yǎng)的級數(shù)，抗生素生產(chǎn)中，放線菌的細(xì)胞生長繁殖較慢，常常采用三級種子擴(kuò)大培養(yǎng)。一般50 t發(fā)酵罐多采用三級發(fā)酵，有的甚至采用四級發(fā)酵，如鏈霉/素生產(chǎn)。有些酶制劑發(fā)酵生產(chǎn)也采用三級發(fā)酵。而谷氨/酸及其他氨基酸的發(fā)酵所采用的菌種是細(xì)菌，生長繁殖速度很快，一般采用二級發(fā)酵。
 

　　種子制備的過程

 

　　細(xì)菌、酵母菌的種子制備就是一個細(xì)胞數(shù)量增加的過程。細(xì)菌的斜面培養(yǎng)基多采用碳源*而氮源豐富的配方，牛肉膏、蛋白胨常用作有機(jī)氮源。細(xì)菌培養(yǎng)溫度大多數(shù)為37 ℃，少數(shù)為28 ℃，細(xì)菌菌體培養(yǎng)時間一般1～2天，產(chǎn)芽孢的細(xì)菌則需培養(yǎng)5～10天。
 

　　霉菌、放線菌的種子制備一般包括兩個過程，即在固體培養(yǎng)基上生產(chǎn)大量孢子的孢子制備和在液體培養(yǎng)基中生產(chǎn)大量菌絲的種子制備過程。
 

　　⒈ 孢子制備
 

　　孢子制備是種子制備的開始，是發(fā)酵生產(chǎn)的一個重要環(huán)節(jié)。孢子的質(zhì)量、數(shù)量對以后菌絲的生長、繁殖和發(fā)酵產(chǎn)量都有明顯的影響。不同菌種的孢子制備工藝有其不同的特點(diǎn)。
 

　　⑴ 放線菌孢子的制備
 

　　放線菌的孢子培養(yǎng)一般采用瓊脂斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有一些適合產(chǎn)孢子的營養(yǎng)成分，如麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些無機(jī)鹽等。碳源和氮源不要太豐富(碳源約為1%，氮源不超過0.5%)，碳源豐富容易造成生理酸性的營養(yǎng)環(huán)境，不利于放線菌孢子的形成，氮源豐富則有利于菌絲繁殖而不利于孢子形成。一般情況下，干燥和限制營養(yǎng)可直接或間接誘導(dǎo)孢子形成。放線菌斜面的培養(yǎng)溫度大多數(shù)為28 ℃，少數(shù)為37 ℃，培養(yǎng)時間為5～14天。
 

　　采用哪一代的斜面孢子接入液體培養(yǎng)，視菌種特性而定。采用母斜面孢子接入液體培養(yǎng)基有利于防止菌種變異，采用子斜面孢子接入液體培養(yǎng)基可節(jié)約菌種用量。菌種進(jìn)入種子罐有兩種方法。一種為孢子進(jìn)罐法，即將斜面孢子制成孢子懸浮液直接接入種子罐。此方法可減少批與批之間的差異，具有操作方便、工藝過程簡單、便于控制孢子質(zhì)量等優(yōu)點(diǎn)，孢子進(jìn)罐法已成為發(fā)酵生產(chǎn)的一個方向。另一種方法為搖瓶菌絲進(jìn)罐法，適用于某些生長發(fā)育緩慢的放線菌，此方法的優(yōu)點(diǎn)是可以縮短種子在種子罐內(nèi)的培養(yǎng)時間。
 

　　⑵ 霉菌孢子的制備
 

　　霉菌的孢子培養(yǎng)，一般以大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為培養(yǎng)基。這是由于這些農(nóng)產(chǎn)品中的營養(yǎng)成分較適合霉菌的孢子繁殖，而且這類培養(yǎng)基的表面積較大，可獲得大量的孢子。霉菌的培養(yǎng)一般為25～28 ℃，培養(yǎng)時間為4～14天。
 

　　⒉ 種子制備
 

　　種子制備是將固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)出的孢子或菌體轉(zhuǎn)入到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使其繁殖成大量菌絲或菌體的過程。種子制備所使用的培養(yǎng)基和其他工藝條件，都要有利于孢子發(fā)芽、菌絲繁殖或菌體增殖。
 

　　⑴ 搖瓶種子制備
 

　　某些孢子發(fā)芽和菌絲繁殖速度緩慢的菌種，需將孢子經(jīng)搖瓶培養(yǎng)成菌絲后再進(jìn)入種子罐，這就是搖瓶種子。搖瓶相當(dāng)于微縮了的種子罐，其培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件與種子罐相似。
 

　　搖瓶種子進(jìn)罐，常采用母瓶、子瓶兩級培養(yǎng)，有時母瓶種子也可以直接進(jìn)罐。種子培養(yǎng)基要求比較豐富和*，并易被菌體分解利用，氮源豐富有利于菌絲生長。原則上各種營養(yǎng)成分不宜過濃，子瓶培養(yǎng)基濃度比母瓶略高，更接近種子罐的培養(yǎng)基配方。
 

　　⑵ 種子罐種子制備
 

　　種子罐種子制備的工藝過程，因菌種不同而異，一般可分為一級種子、二級種子和三級種子的制備。孢子(或搖瓶菌絲)被接入到體積較小的種子罐中，經(jīng)培養(yǎng)后形成大量的菌絲，這樣的種子稱為一級種子，把一級種子轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵，稱為二級發(fā)酵。如果將一級種子接入體積較大的種子罐內(nèi)，經(jīng)過培養(yǎng)形成更多的菌絲，這樣制備的種子稱為二級種子，將二級種子轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵，稱為三級發(fā)酵。同樣道理，使用三級種子的發(fā)酵，稱為四級發(fā)酵。
 

　　種子罐的級數(shù)主要決定于菌種的性質(zhì)和菌體生長速度及發(fā)酵設(shè)備的合理應(yīng)用。種子制備的目的是要形成一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體。孢子發(fā)芽和菌體開始繁殖時，菌體量很少，在小型罐內(nèi)即可進(jìn)行。發(fā)酵的目的是獲得大量的發(fā)酵產(chǎn)物。產(chǎn)物是在菌體大量形成并達(dá)到一定生長階段后形成的，需要在大型發(fā)酵罐內(nèi)才能進(jìn)行。同時若干發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)生菌，其不同生長階段對營養(yǎng)和培養(yǎng)條件的要求有差異。因此，將兩個目的不同、工藝要求有差異的生物學(xué)過程放在一個大罐內(nèi)進(jìn)行，既影響發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量，又會造成動力和設(shè)備的浪費(fèi)。種子罐級數(shù)減少，有利于生產(chǎn)過程的簡化及發(fā)酵過程的控制，可以減少因種子生長異常而造成發(fā)酵的波動。
 

　　種子培養(yǎng)
 

　　種子培養(yǎng)要求一定量的種子，在適宜的培養(yǎng)基中，控制一定的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)方法，從而保證種子正常生長。工業(yè)微生物培養(yǎng)法分為靜置培養(yǎng)和通氣培養(yǎng)兩大類型，靜置培養(yǎng)法即將培養(yǎng)基盛于發(fā)酵容器中，在接種后，不通空氣進(jìn)行培養(yǎng)。而通氣培養(yǎng)法的生產(chǎn)菌種以需氧菌和兼性需氧菌居多，它們生長的環(huán)境必須供給空氣，以維持一定的溶解氧水平，使菌體迅速生長和發(fā)酵，又稱為好氣性培養(yǎng)。
 

　　⒈ 表面培養(yǎng)法
 

　　表面培養(yǎng)法是一種好氧靜置培養(yǎng)法。針對容器內(nèi)培養(yǎng)基物態(tài)又分為液態(tài)表面培養(yǎng)和固體表面培養(yǎng)。相對于容器內(nèi)培養(yǎng)基體積而言，表面積越大，越易促進(jìn)氧氣由氣液界面向培養(yǎng)基內(nèi)傳遞。這種方法菌的生長速度與培養(yǎng)基的深度有關(guān)，單位體積的表面積越大，生長速度越快。
 

　　⒉ 固體培養(yǎng)法
 

　　固體培養(yǎng)又分為淺盤固體培養(yǎng)和深層固體培養(yǎng)，統(tǒng)稱為曲法培養(yǎng)。它起源于我國釀造生產(chǎn)*的傳統(tǒng)制曲技術(shù)。其最大特點(diǎn)是固體曲的酶活力高。
 

　　⒊ 液體深層培養(yǎng)
 

　　液體深層種子罐從罐底部通氣，送入的空氣由攪拌槳葉分散成微小氣泡以促進(jìn)氧的溶解。這種由罐底部通氣攪拌的培養(yǎng)方法，相對于由氣液界面靠自然擴(kuò)散使氧溶解的表面培養(yǎng)法來講，稱為深層培養(yǎng)法。其特點(diǎn)是容易按照生產(chǎn)菌種對于代謝的營養(yǎng)要求以及不同生理時期的通氣、攪拌、溫度與培養(yǎng)基中氫離子濃度等條件，選擇最佳培養(yǎng)條件。
 

　　⑴ 深層培養(yǎng)基本操作的三個控制點(diǎn)
 

　　① 滅菌
 

　　發(fā)酵工業(yè)要求純培養(yǎng)，因此在種子培養(yǎng)前必須對培養(yǎng)基進(jìn)行加熱滅菌。所以種子罐具有蒸汽夾套，以便將培養(yǎng)基和種子罐進(jìn)行加熱滅菌，或者將培養(yǎng)基由連續(xù)加熱滅菌器滅菌，并連續(xù)地輸送于種子罐內(nèi)。
 

　　② 溫度控制
 

　　培養(yǎng)基滅菌后，冷卻至培養(yǎng)溫度進(jìn)行種子培養(yǎng)，由于隨著微生物的生長和繁殖會產(chǎn)生熱量，攪拌也會產(chǎn)生熱量，所以要維持溫度恒定，需在夾套中或盤管中通冷卻水循環(huán)。
 

　　③ 通氣、攪拌
 

　　空氣進(jìn)入種子罐前先經(jīng)過空氣過濾器除去雜菌，制成無菌空氣，而后由罐底部進(jìn)入，再通過攪拌將空氣分散成微小氣泡。為了延長氣泡滯留時間，可在罐內(nèi)裝擋板產(chǎn)生渦流。攪拌的目的除增加溶解氧以外，可使培養(yǎng)液中的微生物均勻地分散在種子罐內(nèi)，促進(jìn)熱傳遞，以及pH均充，并使加入的酸和堿均勻分散等。
 

　　⑵ 幾種深層培養(yǎng)法
 

　　① 控制培養(yǎng)法
 

　　根據(jù)罐內(nèi)部的變化情況，掌握短暫時間內(nèi)狀態(tài)變量的變化以及可能測定的環(huán)境因子對微生物代謝活動的影響，并以此為基礎(chǔ)進(jìn)行控制培養(yǎng)，以達(dá)到產(chǎn)物的*培養(yǎng)條件。為此，用測定狀態(tài)變量的傳感器取得數(shù)據(jù)，經(jīng)電子計(jì)算機(jī)進(jìn)行綜合分析，再將其結(jié)果作為反饋調(diào)節(jié)的信號，將環(huán)境(培養(yǎng)條件)控制于給定的基準(zhǔn)內(nèi)。這就叫做電子計(jì)算機(jī)控制培養(yǎng)。目前已大量用于露天大罐啤酒發(fā)酵。
 

　　② 載體培養(yǎng)法
 

　　載體培養(yǎng)法脫胎于曲法培養(yǎng)，同時又吸收了液體培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，是近年來新發(fā)展的一種培養(yǎng)方法。特征是以天然或人工合成的多孔材料代替麩皮之類的固體基質(zhì)作為微生物的載體，營養(yǎng)成分可以嚴(yán)格控制。發(fā)酵結(jié)束，只要將菌體和培養(yǎng)基擠壓出來進(jìn)行抽提，載體又可以重新使用。
 

　　③ 兩步法
 

　　在酶制劑的兩步法液體深層培養(yǎng)中，每一步菌體相同而培養(yǎng)條件不同，因?yàn)槲⑸锷L與產(chǎn)酶的最適條件有很大的差異。例如往培養(yǎng)基中添加葡萄糖能大大增加菌體或菌絲的生長，然而卻嚴(yán)重阻礙許多種酶的合成。加強(qiáng)培養(yǎng)液的通氣雖然能促進(jìn)微生物的生長，可是在多數(shù)場合下反而抑制酶的合成。為了取得最大的高活力酶，必須制定一種調(diào)節(jié)方法，既要求細(xì)胞的單位酶活力高，又要求細(xì)胞數(shù)量多，也就是說，給菌體在各種生理時期創(chuàng)造不同的條件。兩步法液體深層培養(yǎng)就是實(shí)現(xiàn)這種調(diào)節(jié)的具體措施之一。酶制劑生產(chǎn)兩步法的特點(diǎn)是將菌體生長條件(生長期)與產(chǎn)酶條件(生產(chǎn)期)區(qū)分開來。菌體先在豐富的培養(yǎng)基上大量繁殖，然后收集菌體濃縮物，洗滌后再轉(zhuǎn)入添加誘導(dǎo)物的產(chǎn)酶培養(yǎng)基，在此期間，菌體積累大量的酶，一般不再繁殖，營養(yǎng)成分或誘導(dǎo)物得到充分的利用。
 

　　種子質(zhì)量的控制
 

　　種子質(zhì)量是影響發(fā)酵生產(chǎn)水平的重要因素。種子質(zhì)量的優(yōu)劣，主要取決于菌種本身的遺傳特性和培養(yǎng)條件兩個方面。這就是說既要有優(yōu)良的菌種，又要有良好的培養(yǎng)條件才能獲得高質(zhì)量的種子。
 

　　㈠ 影響孢子質(zhì)量的因素及其控制
 

　　孢子質(zhì)量與培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、濕度、培養(yǎng)時間、接種量等有關(guān)，這些因素相互聯(lián)系、相互影響，因此必須全面考慮各種因素，認(rèn)真加以控制。
 

　　⒈ 培養(yǎng)基
 

　　構(gòu)成孢子培養(yǎng)基的原材料，其產(chǎn)地、品種、加工方法和用量對孢子質(zhì)量都有一定的影響。生產(chǎn)過程中孢子質(zhì)量不穩(wěn)定的現(xiàn)象，常常是原材料質(zhì)量不穩(wěn)定所造成的。原材料產(chǎn)地、品種和加工方法的不同，會導(dǎo)致培養(yǎng)基中的微量元素和其他營養(yǎng)成分含量的變化。例如，由于生產(chǎn)蛋白胨所用的原材料及生產(chǎn)工藝的不同，蛋白胨的微量元素含量、磷含量、氨基酸組分均有所不同，而這些營養(yǎng)成分對于菌體生長和孢子形成有重要作用。瓊脂的牌號不同，對孢子質(zhì)量也有影響，這是由于不同牌號的瓊脂含有不同的無機(jī)離子造成的。
 

　　此外，水質(zhì)的影響也不能忽視。地區(qū)的不同、季節(jié)的變化和水源的污染，均可成為水質(zhì)波動的原因。為了避免水質(zhì)波動對孢子質(zhì)量的影響，可在蒸餾水或無鹽水中加入適量的無機(jī)鹽，供配制培養(yǎng)基使用。例如在配制生產(chǎn)四環(huán)素的斜面培養(yǎng)基時，有時在無鹽水內(nèi)加入0.03%(NH4)2HPO4，0.028%KH2PO4及0.01%MgSO4，確保孢子質(zhì)量，提高四環(huán)素發(fā)酵產(chǎn)量。
 

　　為了保證孢子培養(yǎng)基的質(zhì)量，斜面培養(yǎng)基所用的主要原材料，糖、氮、磷含量需經(jīng)過化學(xué)分析及搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)合格后才能使用。制備培養(yǎng)基時要嚴(yán)格控制滅菌后的培養(yǎng)基質(zhì)量。斜面培養(yǎng)基使用前，需在適當(dāng)溫度下放置一定的時間，使斜面無冷凝水呈現(xiàn)，水分適中有利于孢子生長。
 

　　配制孢子培養(yǎng)基還應(yīng)該考慮不同代謝類型的菌落對多種氨基酸的選擇。菌種在固體培養(yǎng)基上可呈現(xiàn)多種不同代謝類型的菌落，各種氨基酸對菌落的表現(xiàn)不同。氮源品種越多，出現(xiàn)的菌落類型也越多，不利于生產(chǎn)的穩(wěn)定。斜面培養(yǎng)基上用較單一的氮源，可抑制某些不正常型菌落的出現(xiàn)；而對分離篩選的平板培養(yǎng)基則需加入較復(fù)雜的氮源，使其多種菌落類型充分表現(xiàn)，以利篩選。因此在制備固體培養(yǎng)基時有兩條經(jīng)驗(yàn)：① 供生產(chǎn)用的孢子培養(yǎng)基或作為制備砂土孢子或傳代所用的培養(yǎng)基要用比較單一的氮源，以便保持正常菌落類型的優(yōu)勢；② 作為選種或分離用的平板培養(yǎng)基，則需采用較復(fù)雜的有機(jī)氮源，目的是便于選擇特殊代謝的菌落。
 

　　⒉ 培養(yǎng)溫度和濕度
 

　　微生物在一個較寬的溫度范圍內(nèi)生長。但是，要獲得高質(zhì)量的孢子，其最適溫度區(qū)間很狹窄。一般來說，提高培養(yǎng)溫度，可使菌體代謝活動加快，縮短培養(yǎng)時間，但是，菌體的糖代謝和氮代謝的各種酶類，對溫度的敏感性是不同的。因此，培養(yǎng)溫度不同，菌的生理狀態(tài)也不同，如果不是用最適溫度培養(yǎng)的孢子，其生產(chǎn)能力就會下降。不同的菌株要求的最適溫度不同，需經(jīng)實(shí)踐考察確定。例如，龜裂鏈霉菌斜面最適溫度為36.5～37 ℃，如果高于37 ℃，則孢子成熟早，易老化，接入發(fā)酵罐后，就會出現(xiàn)菌絲對糖、氮利用緩慢，氨基氮回升提前，發(fā)酵產(chǎn)量降低等現(xiàn)象。培養(yǎng)溫度控制低一些，則有利于孢子的形成。龜裂鏈霉菌斜面先放在36.5 ℃培養(yǎng)3天，再放在28.5 ℃培養(yǎng)1天，所得的孢子數(shù)量比在36.5 ℃培養(yǎng)4天所得的孢子數(shù)量增加3～7倍。
 

　　斜面孢子培養(yǎng)時，培養(yǎng)室的相對濕度對孢子形成的速度、數(shù)量和質(zhì)量有很大影響。空氣中相對濕度高時，培養(yǎng)基內(nèi)的水分蒸發(fā)少；相對濕度低時，培養(yǎng)基內(nèi)的水分蒸發(fā)多。例如，在我國北方干燥地區(qū)，冬季由于氣候干燥，空氣相對濕度偏低，斜面培養(yǎng)基內(nèi)的水分蒸發(fā)的快，致使斜面下部含有一定水分，而上部易干癟，這時孢子長得快，且從斜面下部向上長。夏季時空氣相對濕度高，斜面內(nèi)水分蒸發(fā)得慢，這時斜面孢子從上部往下長，下部常因積存冷凝水，致使孢子生長得慢或孢子不能生長。試驗(yàn)表明，在一定條件下培養(yǎng)斜面孢子時，在北方相對濕度控制在40%～45%，而在南方相對濕度控制在35%～42%，所得孢子質(zhì)量較好。一般來說，真菌對濕度要求偏高，而放線菌對濕度要求偏低。
 

　　在培養(yǎng)箱培養(yǎng)時，如果相對濕度偏低，可放入盛水的平皿，提高培養(yǎng)箱內(nèi)的相對濕度，為了保證新鮮空氣的交換，培養(yǎng)箱每天宜開啟幾次，以利于孢子生長。現(xiàn)代化的培養(yǎng)箱是恒溫、恒濕，并可換氣，不用人工控制。
 

　　最適培養(yǎng)溫度和濕度是相對的，例如相對濕度、培養(yǎng)基組分不同，對微生物的最適溫度會有影響。培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基組分不同也會影響到微生物培養(yǎng)的最適相對濕度。
 

　　⒊ 培養(yǎng)時間和冷藏時間
 

　　絲狀菌在斜面培養(yǎng)基上的生長發(fā)育過程可分為五個階段：① 孢子發(fā)芽和基內(nèi)菌絲生長階段；② 氣生菌絲生長階段；③ 孢子形成階段；④ 孢子成熟階段；⑤ 斜面衰老菌絲自溶階段。
 

　　⑴ 孢子的培養(yǎng)時間
 

　　基內(nèi)菌絲和氣生菌絲內(nèi)部的核物質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)處于流動狀態(tài)，如果把菌絲斷開，各菌絲片斷之間的內(nèi)容是不同的，有的片斷中含有核粒，有的片斷中沒有核粒，而核粒的多少亦不均勻，該階段的菌絲不適宜于菌種保存和傳代。而孢子本身是一個獨(dú)立的遺傳體，其遺傳物質(zhì)比較完整，因此孢子用于傳代和保存均能保持原始菌種的基本特征。但是孢子本身亦有年輕與衰老的區(qū)別。一般來說衰老的孢子不如年輕孢子，因?yàn)樗ダ系逆咦右言谥鸩竭M(jìn)入發(fā)芽階段，核物質(zhì)趨于分化狀態(tài)。孢子的培養(yǎng)工藝一般選擇在孢子成熟階段時終止培養(yǎng)，此時顯微鏡下可見到成串孢子或游離的分散孢子，如果繼續(xù)培養(yǎng)，則進(jìn)入斜面衰老菌絲自溶階段，表現(xiàn)為斜面外觀變色、發(fā)暗或黃、菌層下陷、有時出現(xiàn)白色斑點(diǎn)或發(fā)黑。白斑表示孢子發(fā)芽長出第二代菌絲，黑色顯示菌絲自溶。孢子的培養(yǎng)時間對孢子質(zhì)量有重要影響，過于年輕的孢子經(jīng)不起冷藏，如土/霉素菌種斜面培養(yǎng)4.5天，孢子尚未*成熟，冷藏7～8天菌絲即開始自溶。而培養(yǎng)時間延長半天(即培養(yǎng)5天)，孢子*成熟，可冷藏20天也不自溶。過于衰老的孢子會導(dǎo)致生產(chǎn)能力下降，孢子的培養(yǎng)時間應(yīng)控制在孢子量多、孢子成熟、發(fā)酵產(chǎn)量正常的階段終止培養(yǎng)。
 

　　⑵ 孢子的冷藏時間
 

　　斜面孢子的冷藏時間，對孢子質(zhì)量也有影響，其影響隨菌種不同而異，總的原則是冷藏時間宜短不宜長。曾有報道，在鏈/霉素生產(chǎn)中，斜面孢子在6 ℃冷藏2個月后的發(fā)酵單位比冷藏1個月的低18%，冷藏3個月后則降低35%。
 

　　⒋ 接種量
 

　　制備孢子時的接種量要適中，接種量過大或過小均對孢子質(zhì)量產(chǎn)生影響。因?yàn)榻臃N量的大小影響到在一定量培養(yǎng)基中孢子的個體數(shù)量的多少，進(jìn)而影響到菌體的生理狀態(tài)。凡接種后菌落均勻分布整個斜面，隱約可分菌落者為正常接種。接種量過小則斜面上長出的菌落稀疏，接種量過大則斜面上菌落密集一片。一般傳代用的斜面孢子要求菌落分布較稀，適于挑選單個菌落進(jìn)行傳代培養(yǎng)。接種搖瓶或進(jìn)罐的斜面孢子，要求菌落密度適中或稍密，孢子數(shù)達(dá)到要求標(biāo)準(zhǔn)。一般一支高度為20 cm、直徑為3 cm的試管斜面，絲狀菌孢子數(shù)要求達(dá)到107以上。
 

　　接入種子罐的孢子接種量對發(fā)酵生產(chǎn)也有影響。例如，青/霉素產(chǎn)生菌之一的球狀菌的孢子數(shù)量對青霉/素發(fā)酵產(chǎn)量影響極大，若孢子數(shù)量過少，則進(jìn)罐后長出的球狀體過大，影響通氣效果；若孢子數(shù)量過多，則進(jìn)罐后不能很好地維持球狀體。
 

　　除了以上幾個因素需加以控制之外，要獲得高質(zhì)量的孢子，還需要對菌種質(zhì)量加以控制。用各種方法保存的菌種每過1年都應(yīng)進(jìn)行1次自然分離，從中選出形態(tài)、生產(chǎn)性能好的單菌落接種孢子培養(yǎng)基。制備好的斜面孢子，要經(jīng)過搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，合格后才能用于發(fā)酵生產(chǎn)。
 

　　㈡ 影響種子質(zhì)量的因素及其控制
 

　　種子質(zhì)量主要受孢子質(zhì)量、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、種齡和接種量等因素的影響。搖瓶種子的質(zhì)量主要以外觀顏色、效價、菌絲濃度或黏度以及糖氮代謝、pH值變化等為指標(biāo)，符合要求方可進(jìn)罐。
 

　　種子的質(zhì)量是發(fā)酵能否正常進(jìn)行的重要因素之一。種子制備不僅是要提供一定數(shù)量的菌體，更為重要的是要為發(fā)酵生產(chǎn)提供適合發(fā)酵、具有一定生理狀態(tài)的菌體。種子質(zhì)量的控制，將以此為出發(fā)點(diǎn)。
 

　　⒈ 培養(yǎng)基
 

　　種子培養(yǎng)基的原材料質(zhì)量的控制類似于孢子培養(yǎng)基原材料質(zhì)量的控制。種子培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分應(yīng)適合種子培養(yǎng)的需要，一般選擇一些有利于孢子發(fā)芽和菌絲生長的培養(yǎng)基，在營養(yǎng)上易于被菌體直接吸收和利用，營養(yǎng)成分要適當(dāng)?shù)刎S富和*，氮源和維生素含量較高，這樣可以使菌絲粗壯并具有較強(qiáng)的活力。另一方面，培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分要盡可能地和發(fā)酵培養(yǎng)基接近，以適合發(fā)酵的需要，這樣的種子一旦移入發(fā)酵罐后也能比較容易適應(yīng)發(fā)酵罐的培養(yǎng)條件。發(fā)酵的目的是為了獲得盡可能多的發(fā)酵產(chǎn)物，其培養(yǎng)基一般比較濃，而種子培養(yǎng)基以略稀薄為宜。種子培養(yǎng)基的pH值要比較穩(wěn)定，以適合菌的生長和發(fā)育。pH值的變化會引起各種酶活力的改變，對菌絲形態(tài)和代謝途徑影響很大。例如，種子培養(yǎng)基的pH值控制對四環(huán)素發(fā)酵有顯著影響。
 

　　⒉ 培養(yǎng)條件
 

　　種子培養(yǎng)應(yīng)選擇最適溫度，前面已有敘述。培養(yǎng)過程中通氣攪拌的控制很重要，各級種子罐或者同級種子罐的各個不同時期的需氧量不同，應(yīng)區(qū)別控制，一般前期需氧量較少，后期需氧量較多，應(yīng)適當(dāng)增大供氧量。在青/霉素生產(chǎn)的種子制備過程中，充足的通氣量可以提高種子質(zhì)量。例如，將通氣充足和通氣不足兩種情況下得到的種子都接入發(fā)酵罐內(nèi)，它們的發(fā)酵單位可相差1倍。但是，在土/霉素發(fā)酵生產(chǎn)中，一級種子罐的通氣量小一些卻對發(fā)酵有利。通氣攪拌不足可引起菌絲結(jié)團(tuán)、菌絲粘壁等異常現(xiàn)象。生產(chǎn)過程中，有時種子培養(yǎng)會產(chǎn)生大量泡沫而影響正常的通氣攪拌，此時應(yīng)嚴(yán)格控制，甚至可考慮改變培養(yǎng)基配方，以減少發(fā)泡。
 

　　對青/霉素生產(chǎn)的小罐種子，可采用補(bǔ)料工藝來提高種子質(zhì)量，即在種子罐培養(yǎng)一定時間后，補(bǔ)入一定量的種子培養(yǎng)基，結(jié)果種子罐放罐體積增加，種子質(zhì)量也有所提高，菌絲團(tuán)明顯減少，菌絲內(nèi)積蓄物增多，菌絲粗壯，發(fā)酵單位增高。
 

　　⒊ 種齡
 

　　種子培養(yǎng)時間稱為種齡。在種子罐內(nèi)，隨著培養(yǎng)時間延長，菌體量逐漸增加。但是菌體繁殖到一定程度，由于營養(yǎng)物質(zhì)消耗和代謝產(chǎn)物積累，菌體量不再繼續(xù)增加，而是逐漸趨于老化。由于菌體在生長發(fā)育過程中，不同生長階段的菌體的生理活性差別很大，接種種齡的控制就顯得非常重要。在工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中，一般都選在生命力極為旺盛的對數(shù)生長期，菌體量尚未達(dá)到最高峰時移種。此時的種子能很快適應(yīng)環(huán)境，生長繁殖快，可大大縮短在發(fā)酵罐中的遲滯期(調(diào)整期)，縮短在發(fā)酵罐中的非產(chǎn)物合成時間，提高發(fā)酵罐的利用率，節(jié)省動力消耗。如果種齡控制不適當(dāng)，種齡過于年輕的種子接入發(fā)酵罐后，往往會出現(xiàn)前期生長緩慢、泡沫多、發(fā)酵周期延長以及因菌體量過少而菌絲結(jié)團(tuán)，引起異常發(fā)酵等等；而種齡過老的種子接入發(fā)酵罐后，則會因菌體老化而導(dǎo)致生產(chǎn)能力衰退。在土/霉素生產(chǎn)中，一級種子的種齡相差2～3 h，轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐后，菌體的代謝就會有明顯的差異。
 

　　最適種齡因菌種不同而有很大的差異。細(xì)菌的種齡一般為7～24 h，霉菌種齡一般為16～50 h，放線菌種齡一般為21～64 h。同一菌種的不同罐批培養(yǎng)相同的時間，得到的種子質(zhì)量也不*一致，因此最適的種齡應(yīng)通過多次試驗(yàn)，特別要根據(jù)本批種子質(zhì)量來確定。