實驗原理
由于RNA的來源和種類很多,因而提取制備方法也很各異。一般有苯/酚法、去污劑法和鹽酸胍法。其中苯/酚法又是實驗是最/常用的。組織勻漿用苯/酚處理并離心后,RNA即溶于上層被酚飽和的水相中,DNA和蛋白質則留在酚層中。向水層加入乙醇后,RNA即以白色絮狀沉淀析出,此法能較好的除去DNA和蛋白質。上述方法提取的RNA具有生物活性。工業(yè)上常用稀堿法和濃鹽法提取RNA,用這兩種方法所提取的核酸均為變性的 RNA,主要用作制備核苷酸的原料,其工藝比較簡單。濃鹽法使用10%左右氯化鈉溶液,90℃提取3-4h,迅速冷卻,提取液經離心后, 上清液用乙醇沉淀RNA。稀堿法使用稀堿使酵母細胞裂解,然后用酸中和,除去蛋白質和菌體后的上清液用乙醇沉淀RNA或調pH2.5利用等電點沉淀。
酵母含RNA達2.67-10.0%,而DNA含量僅為0.03-0.516%,為此,提取RNA多以酵母為原料。
RNA含有核糖、嘌呤堿、嘧啶堿和磷酸各組分。加硫酸煮可使RNA水解,從水解液中可用定糖,定磷和加銀沉淀等方法測出上述組份的存在。
試劑和器材
一、試劑
0.04M NaOH溶液;95%乙醇;1.5M硫酸;濃氨水;0.1M硝/酸銀。
酸性乙醇溶液:30mL乙醇加0.3mL HCl。
三氯化鐵濃鹽溶液:將2mL 10%三氯化鐵(FeCl3· 6H2O)溶液加入400mL濃HCl。
苔黑酚(3,5-二羥基甲苯)乙醇溶液:稱取6g苔黑酚溶于95%乙醇100mL。
定磷試劑:
17%硫酸:將17mL濃硫酸(比重1084)緩緩傾入83mL水中;
2.5%鉬酸銨:2.5g鉬酸銨溶于100mL水中;
10%抗壞血酸溶液:10g抗壞血酸溶于100mL 水,棕色并保存溶液;
臨用時將三種溶液和水按下列比例混合:
17%硫酸:2.5%鉬酸銨:10%抗壞血酸:水=1:1:1:2(V/V)。
二、材料
干/酵母粉。
三、器材
移液管0.2mL(×1),2.0mL(×1), 1mL(×4); 量筒10 mL(×1), 50mL(×1); 滴管;水浴鍋;離心機。
操作方法
一、酵母RNA提取
稱5g干酵/母粉懸浮于30mL 0.04M NaOH溶液中并在研缽中研磨均勻。懸浮液轉入三角燒瓶,沸水浴加熱30min,冷卻,轉入離心管。3000轉/分,離心15分鐘后,將上清慢慢傾入 10mL酸性乙醇,邊加邊攪動。加畢,靜置,待RNA沉淀*后,3000r/min離心3min。棄去上清液。用95%乙醇洗滌沉淀兩次。再用乙/醚洗滌沉淀一次后,用乙/醚將沉淀轉移至布氏漏斗抽濾,沉淀在空氣中干燥。稱量所得RNA粗品的重量,計算:
二、RNA組份鑒定
取2g提取的核酸,加入1.5M硫酸10mL, 沸水浴加熱10分鐘制成水解液,然后進行組份鑒定。
1.嘌呤堿:取水解液1mL 加入過量濃氨水。然后加入1mL 0.1M硝/酸銀溶液,觀察有無嘌呤堿銀化合物沉淀。
2.核糖:取水解液1mL,三氯化鐵濃鹽酸溶液2mL和苔黑酚乙醇溶液0.2mL。放沸水浴中10min。注意觀察核糖是否變成綠色。
3.磷酸:取水解液1mL,加定磷試劑1mL。在水浴中加熱觀察溶液是否變成藍色。