(一)DNA的凝膠電泳:凝膠電泳是分子克隆的中心技術(shù)之一。
瓊脂糖凝膠用于分離大于200~1000bp的片段;操作簡單、快速,且分離范圍廣,分辨率高。
2.聚丙烯酰胺凝膠用于分離5-500bp的片段; 效果好、分辨率*,相差1bp的DNA/片斷就能分開,能容納相對(duì)大量的DNA ,用于核苷酸多態(tài)性的分析。
瓊脂糖凝膠電泳的基本過程
材料:電泳緩沖液(常用TAE或TBE)、電泳級(jí)瓊脂糖、溴化乙錠溶液(核酸顯示劑)、加樣緩沖液(保證核酸不在加樣孔中擴(kuò)散和用于電泳時(shí)間的指示系統(tǒng))、水平凝膠電泳裝置及制膠系統(tǒng)、直流電源系統(tǒng)。
基本過程:制膠→放入電泳槽中并加入電泳緩沖液→取出梳子→將適量的核酸樣品和上樣緩沖液混合并上樣于加樣孔中→一定電壓條件下電泳→合適的時(shí)間后停止電泳→取出凝膠進(jìn)行溴化乙錠染色→凝膠成像系統(tǒng)紫外燈下觀察并照相保存結(jié)果
注意:溴化乙錠具有致癌性,操作時(shí)要帶手套;不同濃度瓊脂糖的凝膠分離范圍;影響DNA在凝膠中遷移速率的因素:1、DNA分子的大小;2、構(gòu)象;3、凝膠濃度;4、電壓;5、緩沖液
特殊的凝膠電泳
1、倒轉(zhuǎn)電場凝膠電泳(FIGE):用于分離分子量10~2000kb的DNA分子;
2、鉗位均勻電場電泳(CHEF電泳):可分離大于107bp的DNA分子。
(二)RNA 電 泳
基本過程同DNA電泳一樣,但應(yīng)明確一點(diǎn)的是,因?yàn)镽NA分子對(duì)RNA酶的作用非常敏感,因此必須用對(duì)RNA酶有抑制作用DEPC水來配置所有溶液,所有與RNA接觸的儀器和裝置都要嚴(yán)格處理以盡量減少RNA酶對(duì)樣品的降解;另外,因?yàn)镽NA分子有二、三級(jí)結(jié)構(gòu)可以影響其電泳結(jié)果,因此電泳時(shí)應(yīng)在變性劑存在下進(jìn)行,常用的變性劑為甲醛和戊二醛。