分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)最大的特點(diǎn)就是好上手、難做好。進(jìn)行DNA、RNA相關(guān)的實(shí)驗(yàn)時(shí)，細(xì)節(jié)顯得尤為重要。今天，遠(yuǎn)慕生物介紹3種鑒定RNA質(zhì)量好壞的方法。從源頭開(kāi)始，把控實(shí)驗(yàn)。
1. 為什么要確定RNA的質(zhì)量
與DNA不同，RNA是極為脆弱的，由于其單鏈結(jié)構(gòu)，RNA的堿基和氫鍵全都暴露在環(huán)境中，極易被環(huán)境中的各種化學(xué)物質(zhì)和RNA酶降解。一旦降解，后期的實(shí)驗(yàn)純屬浪費(fèi)時(shí)間了，然而這一過(guò)程往往是不易察覺(jué)。
良好的實(shí)驗(yàn)環(huán)境和準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)流程控制是保證實(shí)驗(yàn)成功的基本條件。外源性酶是影響實(shí)驗(yàn)的重要因素。RNA實(shí)驗(yàn)需要我們?cè)趯?shí)驗(yàn)流程中不斷自查是否存在問(wèn)題，而RNA質(zhì)量檢測(cè)就是重要的一環(huán)。如果RNA質(zhì)量存在問(wèn)題，后期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)慘不忍睹，什么樣的都有。閑話不多說(shuō)，下面就介紹3種評(píng)價(jià)RNA質(zhì)量方法。
吸光度法測(cè)RNA總量
即紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，經(jīng)常使用。
280、320、230、260nm下的吸光度分別代表了核酸、溶液渾濁度、鹽濃度和蛋白等有機(jī)物的值。我們只看OD260/OD280。理論上，純RNA情況下的OD260/OD280的值為2，可接受的范圍為1.8-2.0。純的DNA情況下的OD260/OD280的值為1.8，可接受的范圍是1.6-1.8。
一般認(rèn)為RNA中的蛋白或是其他有機(jī)物的污染是可以接受的，當(dāng)R<1.8時(shí)，溶液中蛋白或是酚類物質(zhì)殘留。當(dāng)R>2.2時(shí)，說(shuō)明RNA已經(jīng)水解為單核酸。一般的，如果你能做到1.9-2.0之間，說(shuō)明RNA純度已經(jīng)很高了。但是如果你采用Tris作為緩沖液檢測(cè)吸光度時(shí)，R值可能會(huì)＞2(一般應(yīng)＜2.2的)。
個(gè)人推薦的辦法是嚴(yán)格采用閾值1.8-2.0作為判定標(biāo)準(zhǔn)，不符合的RNA樣品丟棄，重新提取，這樣才能最小化誤差。
電泳法譜測(cè)RNA完整性
一般而言，RNA瓊脂糖實(shí)驗(yàn)是為了檢測(cè)RNA的完整性，但是我們也可以從中看出RNA的質(zhì)量好壞。
我們的目的并不是要檢測(cè)RNA的分子量，RNA無(wú)需變性，所以采用普通的1%含EB瓊脂糖凝膠(含EB)即可滿足要求。跑膠結(jié)束后，在紫外燈的照射下，條帶從上到下分別為28S、18S、5S，這是真核生物的特征。28S和18S 條帶最明亮、清晰、條帶邊緣銳利，最重要的是28S條帶的亮度大概是18S條帶的兩倍或者以上，這種情況RNA的質(zhì)量是很好的，如果需要更細(xì)致一點(diǎn)，可能采用Image J測(cè)量一下條帶的灰度值，其測(cè)量方法和蛋白一樣。
保溫法RNA是否酶污染
上面2種方法都是采用物理的方法進(jìn)行檢測(cè)，但是我們無(wú)法得知所抽提的RNA是否有RNA酶污染。很多人沒(méi)有注意這一點(diǎn)，認(rèn)為使用了無(wú)RNA酶實(shí)驗(yàn)器材，哪里還有RNA酶啊。事實(shí)就是這么悲慘！甚至認(rèn)為這是相關(guān)試驗(yàn)失敗的重要原因。畢竟，很少有人會(huì)意識(shí)并且驗(yàn)證這一點(diǎn)。
RNA酶比較頑強(qiáng)，單純加溫也很難滅活，必須使用DEPC。實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中其實(shí)存在很多RNA酶，這些酶大多來(lái)源于人的呼吸和唾沫。你可以保證自己帶口罩實(shí)驗(yàn)，但是你可能很難要求同處一室的其他人都帶上口罩。很多高質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)室會(huì)開(kāi)通PCR專用實(shí)驗(yàn)間，他們的實(shí)驗(yàn)往往比較順利。
RNA保溫實(shí)驗(yàn)原理:
很簡(jiǎn)單，就是取一點(diǎn)樣品，人為的升溫并保持一段時(shí)間，接著通過(guò)瓊脂糖跑膠的操作。如果存在RNA酶，那么RNA條帶的28S和18S肯定模糊不清，而5S會(huì)發(fā)亮，并且條帶拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重。
網(wǎng)上有一份RNA保溫試驗(yàn)方法，還是比較好的。貼上來(lái)給大家看看:
“從RNA溶液中吸取兩份1000ng的RNA加入至0.5ml 的離心管中，并且用pH7.0的Tris緩沖液補(bǔ)充到10ul的總體積，然后密閉管蓋。把其中一份放入70℃的恒溫水浴中，保溫1h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1h。時(shí)間到了之后，取出兩份樣本進(jìn)行電泳。電泳完成后，比較兩者的電泳條帶。如果兩者的條帶一致或者無(wú)明顯差別，則說(shuō)明RNA溶液中沒(méi)有殘留的RNA酶污染，RNA的質(zhì)量很好。相反的，如果70℃保溫的樣本有明顯的降解，則說(shuō)明RNA溶液中有RNA酶污染。"
