一、概念
1、細(xì)胞系(Cell Line):原代培養(yǎng)舞經(jīng)*傳代成功即成細(xì)胞系,由原先存在于原代培養(yǎng)物中的細(xì)胞世系(Lineage of Cells)所組成。
2、細(xì)胞株(Cell Strain):通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志物稱為細(xì)胞株。細(xì)胞株的特殊性質(zhì)或標(biāo)志必須在整
個培養(yǎng)期間始終存在。如果不能繼續(xù)傳代或傳代數(shù)有限,稱為有限細(xì)胞株(finitecell strain);如果可以連續(xù)傳代,稱為連續(xù)細(xì)胞株(continuous cellstrain)。對于人類腫瘤細(xì)胞,在體外培養(yǎng)半年以上,生長穩(wěn)定,并連續(xù)傳代的即可稱為連續(xù)性株或系。
二、建立細(xì)胞系(或株)的要求
什么樣的體外培養(yǎng)群可被認(rèn)可為己鑒定的細(xì)胞,視具體情況而定,無統(tǒng)一規(guī)定。對于用作原代培養(yǎng)的細(xì)胞只要供體均一,取材部位及組織種類等條件穩(wěn)定即可,如用做長期培養(yǎng),特別是反復(fù)傳代的細(xì)胞,常需做如下說明:
1、組織來源:細(xì)胞供體所屬物種,來自人體或者動物;
個體性別、年齡;取材的器官或組織。
如系腫瘤組織,應(yīng)說明臨床和病理診斷,以及病歷號等。
2、細(xì)胞生物學(xué)檢測:
了解細(xì)胞一般和特殊的生物學(xué)性狀,如細(xì)胞一般形態(tài),特異結(jié)構(gòu),細(xì)胞生長曲線和分裂指數(shù),倍增時間,接種率等。
如為腫瘤細(xì)胞,為說明來源于原腫瘤組織并保持惡性,須做軟瓊脂培養(yǎng),異體接種致瘤和對正常組織侵潤力等實驗。
3、培養(yǎng)條件和方法;應(yīng)說明細(xì)胞系(或株)適應(yīng)的生存環(huán)境,即指明使用的培養(yǎng)基、血清種類、用量以及適宜PH值。
三、若干細(xì)胞建株的要點及基本過程
(一)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)要點
1、取材:材料主要來源于外科手術(shù)或活檢瘤組織,取材時避免用壞死組織,要挑選瘤細(xì)胞集中和活力較好的部位,瘤性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)或胸腹水是較好的培養(yǎng)
材料。取材后盡快培養(yǎng),因故不能立即培養(yǎng)者,可凍存。其培養(yǎng)方法及凍存方法同前述正常組織。
2、成纖維細(xì)胞排除:在腫瘤組織中?;祀s有一些成纖維細(xì)胞,培養(yǎng)時能與瘤細(xì)胞同時生長,并常壓過癌細(xì)胞,導(dǎo)致癌細(xì)胞生長受阻以至消失,應(yīng)仔細(xì)排除。排除方法常有:機(jī)械刮除法、反復(fù)貼壁法、消化排除法、膠原酶消化法等。
3、提高腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)存活率和生長率
根據(jù)實驗經(jīng)驗,腫瘤細(xì)胞在體外不易培養(yǎng),建立能傳代的腫瘤細(xì)胞系更為困難。一般當(dāng)腫瘤組成或細(xì)胞被原代培養(yǎng)后,要經(jīng)過對新環(huán)境的適應(yīng)才能生長,因此不能局限于一般培養(yǎng)法,須采用一些特殊措施。如:用適宜底物,鼠尾膠原底層及飼細(xì)胞底層等。用細(xì)胞生長因子,根據(jù)細(xì)胞種類不同選用不同的促細(xì)胞生長因子,如胰島素、氫化-可的松,雌激素等。也可以考慮動物媒介培養(yǎng)。
(二)人類淋巴母細(xì)胞建株方法
l、4ml肝素抗凝血于離心管中,加入2ml RPMI 1640。
2、混勻后沿管壁緩慢加到預(yù)置有4ml淋巴細(xì)胞分離液的液面上靜置30min。
3、1500rpm,15min,吸取白細(xì)胞層(第二層)于另一離心管中。
4、加RPMI 1640 5ml洗滌白細(xì)胞兩次。
5、將白細(xì)胞接種至1ml RPMI 1640培養(yǎng)基中,加入10μl環(huán)胞霉素和100μl的EBV(EB病毒)液,混勻。
6、水浴搖床,40次/分,37℃,3hr。
7、1500rpm,15min。將細(xì)胞接種至1ml培養(yǎng)基中(內(nèi)含谷氨酰胺1mM/ml)加入10μl環(huán)胞霉素,輕輕混勻,37℃培養(yǎng)。
8、5天后觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)化和生長情況,決定是否半量換液。一般半量換液l—2次,并維持環(huán)胞霉素的濃度。
9、待轉(zhuǎn)化細(xì)胞數(shù)量明顯上升,并出現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)塊后,可轉(zhuǎn)入25ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,加1—2ml培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)10—15天,一般每隔3—4天觀察一次,決定是否 換液,傳代。
10、細(xì)胞生長達(dá)一定數(shù)量后凍存,凍存前應(yīng)進(jìn)行核型分析和存檔。