植物DNA的提取和純化是植物基因工程研究的基礎(chǔ)操作。實(shí)施分子標(biāo)記、基因圖譜、基因指紋圖譜、基因文庫(kù)構(gòu)建、遺傳多態(tài)性分析、DNA重組、RAPD(隨機(jī)引物多態(tài)性DNA)、RFLP(限制性酶多態(tài)性)、基因分離及遺傳轉(zhuǎn)化和鑒定等都以提取DNA為前提。
目前,對(duì)從植物組織中提取DNA方法的要求是:簡(jiǎn)便、有效、快捷以及經(jīng)濟(jì)。與動(dòng)物組織相比,植物組織含有較多的多糖和其他次生代謝產(chǎn)物(酚、酯、萜、色素等),這給高質(zhì)量的DNA提取帶來(lái)較多的困難。尤其是多糖成分是影響DNA純度-常見(jiàn)的問(wèn)題。如何做到既去除這些污染物又能相對(duì)保持高的產(chǎn)量,并且能簡(jiǎn)捷有效地提純,一直是植物生物技術(shù)研究者探索的問(wèn)題。
對(duì)于普通的植物(低酚、低酯、低糖等)如:水稻、白菜、莧菜、南瓜、黃瓜、西紅柿、上海青、菠菜、筍瓜、冬瓜、蓮藕、山藥、竹筍等;我們可以選用普通植物DNA提取試劑盒(磁珠法)試劑
對(duì)于多糖、多酚類(lèi)植物(香蕉、西瓜、蘋(píng)果、梨等果肉,紅薯、馬鈴薯等塊莖,棉花、月季、枇杷、益母草、夏枯草等人參、曼陀羅、向天果、射干、桔梗、滿山紅、金雞納霜等藥用植物)可以選用多酚植物DNA提取試劑盒(磁珠法)試劑,針對(duì)類(lèi)似的植物我們經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的優(yōu)化,可以得到較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
以葉片為例,葉片需先剪碎成小塊,以便放入1.5ml離心管。-佳樣本的長(zhǎng)度應(yīng)在1cm 以下。重量不超過(guò)250mg,推薦使用50mg,如果是植物種子粉末可以使用10mg-20mg粉末即可。
一、勻漿介質(zhì)
一般采用 0.05 mol/L Tris-HCl,pH 7.4 磷酸鹽緩沖液(PBS),客戶可根據(jù)樣本及測(cè)定方針的狀況自行設(shè)定濃度,目的是堅(jiān)持樣本的等滲環(huán)境。
二、組織勻漿的制備
1、取組織塊(0.2g~0.5g)可到 5~10mg 在嚴(yán)寒的 PBS 中漂洗,濾紙拭干,稱(chēng)重,放入 5ml 的勻漿管中。
2、按重量 (g):體積 (ml)=1:4 的比例參與 4 倍體積的勻漿介質(zhì)于勻漿管中,冰水浴條件下,用眼科小剪趕快剪碎組織塊。
3、勻漿的方法:手工勻漿,機(jī)器勻漿。
① 手工勻漿:左手持勻漿管將下端刺進(jìn)盛有冰水混合物的器皿中,右手將搗桿筆直刺進(jìn)套管中,上下轉(zhuǎn)動(dòng)研磨數(shù)十次(6~8 分鐘),充沛研碎,制成 20% 的勻漿液。
② 機(jī)器勻漿:用組織搗碎機(jī) 10000~15000 轉(zhuǎn) / 分 上下研磨制成 20% 組織勻漿,也可用內(nèi)切式組織勻漿機(jī)制備(勻漿時(shí)間 10 秒 / 次,空隙 30 秒,接連 3~5 次,在冰水中進(jìn)行,可適當(dāng)延伸勻漿時(shí)間),
4、將制備好的 20% 勻漿液用一般離心機(jī)或低溫低速離心機(jī) 4000 轉(zhuǎn) / 分左右,離心 10~15 分鐘,取上清液進(jìn)行測(cè)定.
三、樣本保存
植物組織樣本暫時(shí)不測(cè)定,可立即低溫凍存,溫度越低越好,中心如不重復(fù)凍融,-20 ℃ 以下可保存三個(gè)月,-70 ℃ 以下可保存六個(gè)月。 制備好的勻漿液主張不要凍存,當(dāng)天進(jìn)行測(cè)定,如放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)相關(guān)酶活會(huì)有所下降,部分方針 4 ℃ 可存放 3~5 天(如 SOD 要存放 2~3 天,MDA 可存放 3~5天,總蛋白測(cè)定可存 5~7 天)。