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三代測序技術已經應用這么普遍了?
點擊次數:726 更新時間:2020-07-01

三代測序技術興起已經不是一天兩天的事情,可是好多小伙伴對它的認知好像僅僅限于一個名詞,沒有具體去深入了解過,以為可能就是跟現在的二代測序技術沒有什么差別,只是升級版而已,小編很負責任的告訴你,在你不知道的時間里,它已經成為科研領域*的一種主流技術,廣泛應用于基因組Denovo、全長轉錄本檢測、宏基因組、重測序和變異檢測等多個方向,并且在染色體結構變異(SV)的檢測中有著不可替代的優勢。

特別是隨著近兩年 eccDNA(extrachromosomal circular DNA)即染色體外環狀DNA成為科研界的寵兒,三代測序技術geng是被推上了浪潮的。

第三代測序技術主要有兩大技術:

第1是單分子實時熒光測序,脫氧核苷酸用熒光標記,顯微鏡可以實時記錄熒光的強度;當熒光標記的脫氧核苷酸被摻入DNA鏈的時候,它的熒光就同時在DNA鏈上被探測到;當它與DNA鏈形成化學鍵的時候,它的熒光基團就被DNA聚合酶切除,熒光消失。這種熒光標記的脫氧核酸不會影響DNA聚合酶的活性,并且在熒光被切除之后,合成的DNA鏈和天然的DNA鏈*一樣。

優點:

(1)可以通過檢測相鄰兩個堿基之間的測序時間,來檢測一些堿基修飾情況,即如果堿基存在修飾,則通過聚合酶時的速度會減慢,相鄰兩峰之間的距離增大,可以通過這個來直接檢測甲基化等信息

(2)測序速度很快,每秒約10 個dNTP

(3)讀長長(約50kb):超長讀長可獲得mRNA全長序列及完整結構信息,提高拼接效率,轉錄本無需拼接;克服無參考基因組物種轉錄本拼接短、信息不完整的難題;實現有參考基因組物種研究可變剪切及融合基因等結構變異。精-準重構轉錄組/基因組全貌

(4)直接對原始DNA/RNA樣本測序,無需PCR擴增,無GC偏好性

(5)需要的樣品量很少,樣品制備時間花費少

缺點:

(1)測序錯誤率比較高(這幾乎是目前單分子測序技術的通病),達到15%

好在它的出錯是隨機的,并不會像第二代測序技術那樣存在測序錯誤的偏向,因而可以通過多次測序來進行有效的糾錯

(2)依賴DNA聚合酶的活性

(3)成本比二代測序較高

第二是納米孔測序,新型納米孔測序法(nanopore sequencing)是采用電泳技術,借助電泳驅動單個分子逐一通過納米孔來實現測序的;由于納米孔的直徑非常小,僅允許單個核苷酸聚合物通過,而ATCG單個堿基的帶電性質不一樣,通過電信號的變化差異就能檢測出通過的堿基類別,從而實現測序。

優點:

(1) 測序讀長:大約在幾十kb,甚至100 kb,理論上只要DNA分子不斷開就可以一直通過納米孔(比如很火的eccDNA,往往比較大,并且往往攜帶多個染色質來源的序列,因此僅用二代測序很難完整構建出eccDNA的全長序列。三代測序技術顯著提高了測序中分子讀長的問題,可以用于eccDNA的全長序列鑒定)

(2) 可以直接讀取甲基化的胞嘧啶,不必像二代測序那樣需要對基因組進行bisulfite處理(怎么理解:也就是用三代測序做一個全基因組測序的話,可以同時有DNA甲基化的數據分析)

(3) 測序通量很高(30x人類基因組有望在一天內完成);

(4) 起始DNA在測序過程中不被破壞;

(5) 以及樣品制備簡單又便宜

缺點:

(1) 測序準確率:Nanopore測序準確率和Pacbio持平,為86%左右。而且起始位置正確率偏低,在大約100nt位置達到穩定,且錯誤為隨機測序錯誤。如果是對DNA正負鏈都進行測序,可以達到96%的準確率

(2) 切斷的核苷酸可能被讀錯方向

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