一、實驗目的
(1)通過細胞色序C的制備,了解制備蛋白質制品的一般原理和步驟
(2)掌握制備細胞色素C的操作技術及含量的測定方法
二、實驗原理
細胞色素是一類含有鐵 啉基團的電子傳遞蛋白,只存在于需氧細胞中。細胞色素在線粒體內膜上起傳遞電子的作用。細胞色C (cytochrome c) 是細胞色素一種。它在線粒體呼吸鏈上位于細胞色素B 和細胞色素氧化酶之間,是呼吸鏈的一個重要組成部分。每分子細胞色素C含有一個血紅素和一條多肽鏈?,F已從許多來源獲得細胞色素C結晶,并已對100多種細胞色素C蛋白的一級結構進行了測定。結果表明,細胞色素C的氨基酸殘基的數目在103~113之間;不同來源細胞色素C的的氨基酸殘基的順序及含量都有一定的差異。細胞色素C中賴氨酸含量較高,等電點為10.7,含鐵量為0.38%~0.43%,Mr為12000~13000,豬心細胞色素C分子量12200。細胞色素C是一種穩定的可溶性蛋白,它易溶于水及酸性溶液,故常用酸性水提取。細胞色素C分為氧化型和還原型兩種,氧化型水溶液呈深紅色,還原型水溶液呈桃紅色。細胞色素C對熱比較穩定,不易變性。pH 7.2~10.2, 100℃加熱3分鐘,細胞色素C氧化型和還原型變性程度均為18%~28%,若增加加熱時間,氧化型的不可逆變性程度比還原型的為高。細胞色素C對酸堿也較穩定,可抵抗0 .3mol/L氫氧化鉀溶液的長時間處理。一般都將細胞色素C制成還原型的,因為比較穩定并易于保存。
三、試劑與器材
絞肉機、電磁攪拌器、離心機、分光光度計、玻璃柱、下口瓶、燒杯等。
四、操作方法
材料處理—提取—中和—吸附—洗脫—鹽析—沉淀—透析—測定
五、關鍵步驟與注意事項
① 吸附前必須把人造沸石處理好,裝柱時避免柱內出現氣泡,沿柱壁緩緩流入柱內。
② 洗脫時洗脫液一旦變白,立刻停止收集。洗脫完畢人造沸石可再生使用。