已經提出過許多方法用于從細菌中提純質粒DNA， 這些方法都含有以下3個步驟：
    細菌培養物的生長。
    細菌的收獲和裂解
    質粒DNA的純化。

    （一）細菌培養物的生長
    從瓊脂平板上挑取一個單菌落，接種到培養物中(有含有行當抗生素的液體培養基中生長)，然后從中純化質粒，質粒的提純幾乎總是如此。現在使用的許多質粒載體（如pUC系列）都能復制到很高的拷貝數，惟致只要將培養物放在標準LB 培養基中生長到對數晚期，就可以大量提純質粒。此時，不必造反性地擴增質粒DNA。然而，較長一代的載體(如pBR322)由于不能如此自由地復制，所以需要在得到部分生長的細菌培養物中加入lv霉素繼續培養若干小時，以便對質粒進行性擴增。lv霉素可抑制宿主的蛋白質合成，結果阻止了細菌染色體的復制，然而，松弛型質粒仍可繼續復制，在若干小時內，其拷貝數持續遞增。這樣，像pBR３２２－類的質粒，從經lv霉素處理和未經處理的培養物中提取質粒的產量迥然不同，前者大為增高。多年來，加入足以*抑制蛋白質合成的lv霉素μg/ml)已成為標準的操作、用該方法提取的質粒DNA量，對于分子克隆中幾乎所有想象到的工作任務。

    （二）細菌的收獲和裂解
    細菌的收獲可通過離心來進行，而細菌的裂解則可以采用多種方法中的任意一種，這些方法包括用非離子型或離子型去污劑、有機溶劑或堿進行處理及用加熱處理等。選擇哪一種方法取決于３個因素：質粒的大小、小腸桿菌菌株及裂解后用于純化質粒DNA的技術。 盡管針對質粒和宿主的每一種組合分別提出精que的裂解條件不切實際，但仍可據下述一般準則來選擇適當方法，以取得滿意的結果。
    1)大質粒(大于15kb)容易受損，故應采用漫和裂解法從細胞中釋放出來。將細菌懸于蔗糖等滲溶液中，然后用溶菌酶和EDTA進生處理，破壞細胞壁和細胞外膜，再加入SDS一類去污劑溶解球形體。這種方法zui大限度地減小了從具有正壓的細菌內部把質粒釋放出來所需要的作用力。
    2)可用geng劇烈的方法來分離小質粒。在加入EDTA后，有時還在加入溶菌酶后讓細菌暴露于去污劑，通過煮沸或堿處理使之裂解。這些處理可破壞堿基配對，故可使宿主的線狀染色體DNA變性，但閉環質粒DNA鏈由于處于拓撲纏繞狀態而不能彼此分開。當條件恢復正常時，質粒DNA鏈迅速得到準確配置，重新形成*天然的超螺旋分子。
    3)一些大腸桿菌菌株(如HB101的一些變種衍生株) 用去污劑或加熱裂解時可釋放相對大量的糖類，當隨后用lv化銫－溴化乙錠梯度平衡離心進行質粒純化時它們會惹出麻煩。糖類會在梯度中緊靠超螺旋質粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的區帶。因此很難避免質粒DNA內污染有糖類，而糖類可抑制多種限制酶的活性。 故從諸 如HB101和TG1等大腸桿菌蓖株中大量制備質粒時，不宜使用煮沸法。
    4)當從表達內切核酸酶A的大腸桿菌菌株(endA+株，如HB101) 中小量制備質粒時，建議不使用煮沸法。因為煮沸不能*滅活內切核酸酶A，以后在溫育(如用限制酶消化)時，質粒DNA會被降解。但如果通過一個附加步驟(用酚：lv仿進行抽提)可以避免此問題。
    ５)目前這一代質粒的拷貝數都非常高，以致于不需要用lv霉素進行選擇性擴增就可獲得高產。然而，某些工作者沿用lv霉素并不是要增加質粒DNA的產量，而是要降低細菌細胞在用于大量制備的溶液中所占體積。大量高度粘稠的濃縮細菌裂解物，處理起來煞為費事，而在對數中期在增減物中加入lv霉素可以避免這種現象。有lv霉素存在時從較少量細胞獲得的質粒DNA的量以與不加lv霉素時從較大量細胞所得到的質粒DNA的量大致相等。

    (三)質粒DNA的純化
    常使用的所有純化方法都利用了質粒DNA 相對較小及共價閉合環狀這樣兩個性質。例如，用lv化銫－溴化乙錠梯度平衡離心分離質粒和染色體DNA 就取決于溴化乙錠與線狀以及與閉環DNA分子的結合量有所不同。 溴化乙錠通過嵌入奮不顧身堿基之間而與DNA結合，進而使雙螺旋解旋。由此導致線狀DNA的長度有所增加，作為補償，將在閉環質粒DNA中引入超螺旋單位。zui后，超螺旋度大為增加， 從而阻止了溴化乙錠分了的繼續嵌入。但線狀分子不受此限，可繼續結合geng多的染料，直至達到飽和( 每２個堿基對大約結合１個溴化乙錠分子) 。由于染料的結合量有所差別，線狀和閉環DNA分了在含有飽和量溴化乙錠的lv化銫度中的浮力密度也有所不同。多年來，lv化銫－溴化乙錠梯度平衡離心已成為制備大量質粒DNA 的shou選方法。然而該過程既昂貴又費時，為此發展了許多替代方法。其中主要包括利用離子交換層析、凝膠過濾層析、分級沉淀等分離質粒DNA和宿主DNA的方法。本實驗室采用離子交換層析法已可得到*純度的質粒。另外，現在已可買到現成的純化KIT。

    二、質粒DNA的小量制備
    細菌的收獲和裂解
    收獲
    堿裂解法
    煮沸裂解
    質粒ＤＮＡ小量制備的問題與對策
    質粒ＤＮＡ的小量制備可采用下述的堿裂解法或煮沸法

    （一）細菌的收獲和裂解
    １．收獲
    １）將2ml含相應抗生素的ＬＢ加入到容量為15ml 并通氣良好（不蓋緊）的試管中，然后接入一單菌落，于30℃劇烈振搖下培養過夜。
    ２）將1.5ml培養物倒入微量離心管中，用微量離心機于4℃以12000g離心30秒，將剩余的培養物貯存于4℃。
    ３）吸去培養液，使細菌沉淀盡可能干燥。除去上清的簡便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，輕緩抽吸，并用吸頭接觸液面。當液體從管中吸出時，盡可能使吸頭遠離細菌沉淀，然后繼續用吸頭通過抽真空除去附于管壁的液滴。
    ２．堿裂解法
    １）將細菌沉淀，所得重懸于100μl用冰預冷的溶液Ｉ中，劇烈振蕩。
    溶液Ｉ
    50mmol/L葡萄糖
    25mmol/L Tris．Cl(pH8.0)
    10mmol/LEDTA(pH8.0)
    溶液Ｉ可成批配制，每瓶約100ml,在10lbf/in2(6.895×104Pa) 高壓下蒸氣滅菌15分鐘，貯存于4℃。須確使細菌沉淀在溶液Ｉ中*分散，將兩個微量離心管的管底部互相接觸震蕩，可使沉淀迅速分散。
    ２）加200μl新配制的溶液Ⅱ。
    溶液Ⅱ
    0.2mol/L NaOH（臨用前用10mol/L貯存液現用現稀釋）
    1%SDS
    蓋緊管口，快速顛倒離心管５次，以混合內容物。應確保離心管的整個內表面
    均與溶液Ⅱ接觸。不要振蕩，將離心管放置于冰上。
    ３）加150μl用冰預冷的溶液Ⅲ
    溶液Ⅲ
    5mol/Ｌ乙酸鉀 60ml
    冰乙酸 11.5ml
    水 28.5ml
    所配成的溶液對鉀是3mol/L，對乙酸根是5mol/L。
    蓋緊管口，將管倒置后和地振蕩10秒鐘溶液Ⅲ在粘稠的細菌裂解物中分散均勻，之后
    將管置于冰上３－５分鐘。
    ４）用微量離心機于4℃12 000g離心5分種，將上清轉移到另一離心管中。
    ５）可做可不做：加等量酚：lv念， 振蕩混勻， 用微量離心機于4 ℃以12000g離心
    ２分鐘，將上清轉移到另一良心管中。有些工作者認為不*酚：lv仿進行抽提，然而由于一些未知的原因，省略這一步，往往會得到可耐受限制酶切反應的DNA。
    ６）用２倍休積的乙醇于室溫沉淀雙錠DNA。振蕩混合， 于室溫放置２分鐘。
    ７）用微量離心機于4℃以12 000g離心５分鐘。
    ８）小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。除去上清的簡便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，并用吸頭接觸液面。當液體從管中吸出時，盡量使吸頭遠離核酸沉淀，然后繼續用吸頭通過抽真空除去附于管壁的液滴。
    ９）用1ml70%乙醇于4℃洗滌雙鏈DNA沉淀，按步驟8）所術方法去掉上清，在空氣中使核酸沉淀干燥10分鐘。
    i.此法制備的高拷貝數質粒（如Ｘf3或pUC），其產量一般約為：每毫升原細菌培養物3－5μg。
    ii．如果要通過限制酶切割反應來分析DNA，可取1μl DNA溶液加到另一含８μl水的微量離心管內，加1μl 10×限制酶緩沖液和１單位所需限制酶， 在適宜溫育1－2小時。將剩余的DNA貯存于－20℃。
    iii.此方法按適當比例放大可適用于100ml細菌培養物：

    ３．煮沸裂解
    １）將細菌沉淀，所得重懸于350μlSTET中。
    STET
    0.1mol/L NaCL
    10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
    1mmol/L EDTA(pH8.0)
    5% Triton X-100
    ２）加25μl新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,用10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)配制]，振蕩3秒鐘以混勻之。如果溶淮中pH低于8.0，溶菌酶就不能有效發揮作用。
    ３）將離心管放入煮沸的水浴中，時間恰為40秒。
    ４）用微量離心機于室溫以12 000g離心10分種。
    ５）用無菌牙簽從微量離心管中去除細菌碎片。
    ６）在上清中加入40μl 5mol/L乙酸鈉（pH5.2）和420μl異丙醇，振蕩混勻，于室溫放置5分鐘。
    ７）用微量離心機于4℃以12 000g離心5分種，回收核酸沉淀。
    ８）小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。除去上清的簡便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，輕緩抽吸，并用吸頭接觸液面。當液體從管中吸出時，盡可能使吸頭遠離核酸沉淀，然后繼續用吸頭通過抽真空除去附于管的液滴。
    ９）加1ml 70％乙醇，于4℃以12 000g離心２分鐘。
    10）按步驟8）所述再次輕輕地吸去上清，這一步操作要格外小心，因為有時沉淀塊貼壁不緊，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打開管口，放于室溫直至乙醇揮發殆盡，管內無可見的液體（2－5）分鐘。
    11）用50μl含無DNA酶的胰RNA酶（20μg/ml）的TE(pH8.0)溶解核酸稍加振蕩，貯存于-20℃。
    注：當從表達內切核酸酶Ａ的大腸桿菌株（endA+株，如HB101 ）中小量制粒尤其DNA時，建議舍棄煮沸法。因為煮沸步驟不能*滅活內切核酸酶Ａ，以后在Mg2+存在下溫育（V中用限制酶時）質粒DNA可被降解。 在上述方案的步驟９）之間增加一步，即用酚：lv仿進行抽提，可以避免這一問題。