69久久夜色精品国产69,免费观看的av毛片的网站,在厨房乱子伦对白,中文字幕无码日韩欧毛

上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司

怎樣選擇合適的載體----@遠(yuǎn)慕新聞
點擊次數(shù):701 更新時間:2020-03-17

研究基因功能的生物醫(yī)學(xué)小白在課題zui開始往往都是從構(gòu)建一些必要的載體入手。那面對眼花繚亂的載體list(無論是Addgene還是公司)小白們geng是無從下手。讀完本文,小白們會在一夜之間成為載體構(gòu)建的“老si機”。
 
   大體上來說,我們研究功能無非就是在體外(in vitro)和體內(nèi)(in vivo)兩種實驗體系中對我們的目的基因功能加以描述,如圖1所示。

 
圖1 基因功能研究的兩種類型。
  對于體外研究中的細(xì)胞系(或者原代細(xì)胞),我們geng多會選擇轉(zhuǎn)染、慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或者腺病毒;而對于體內(nèi)研究,我們主要選擇購買遺傳修飾的動物模型,或者直接選用AAV介導(dǎo)的遺傳干預(yù)。
  基因功能研究無非就是三種手段-①過表達(dá)、②敲低(減)表達(dá)、③敲除,剩余的就是檢測這三種干預(yù)手段對功能表型的定量和定性影響。下面我們分述在哺乳動物細(xì)胞實施這三種干預(yù)手段分別對應(yīng)的載體選擇。
 
  一、過表達(dá)
過表達(dá)的意思就是人為過量表達(dá)你的目的基因。這一類型的載體選擇主要關(guān)注一下兩點:
1、啟動子
對于哺乳動物細(xì)胞來說,常見載體的泛表達(dá)啟動子常見的基本就這幾個-CMV, SV40, EF1a, CAG。大部分都選擇CMV、CAG或者EF1a其中之一即可,SV40表達(dá)能力稍弱。但對于免疫細(xì)胞、干細(xì)胞我們推薦選擇EF1a即可
比如圖2所示的載體是哺乳動物zui常用的過表達(dá)載體。需要說明的是,對于其他模式生物的細(xì)胞,比如細(xì)菌、酵母、果蠅、線蟲、昆蟲、爪蟾等并不適用。
 
 
圖2 pCDNA3.1是哺乳動物中過表達(dá)zui常用的商業(yè)化載體類型。其目的基因得分啟動子是CMV。
 
2、標(biāo)簽
如果過表達(dá)是編碼蛋白的基因,通常我們會建議加個標(biāo)簽(Epitope tag)。其目的是給過表達(dá)的目的基因做個特殊標(biāo)記,從而有利于后續(xù)的檢測(你的過表達(dá)確定表達(dá)了么?表達(dá)量如何?)。
所以這種標(biāo)簽通常體積較小,不會影響目的蛋白的構(gòu)象、定位、功能等。比較常用的標(biāo)簽有FLAG、HA、Myc、GFP等,我們一個基因通常只需選一種即可,不過有時候這些標(biāo)簽需要多串聯(lián)幾個(比如,3´FLAG,3´HA,6´Myc等)一起增強檢測的靈敏度。我們不講標(biāo)簽的區(qū)別,他們本質(zhì)上都是一段可以編碼蛋白的基因片段。
載體構(gòu)建的時候我們的目的基因跟這些標(biāo)簽都是融合表達(dá)在一起的(通常標(biāo)簽位于目的基因的下游,也叫做(基因的)3‘端,(蛋白的)C端)(圖3),后續(xù)我們只需要購買能特異性識別對應(yīng)標(biāo)簽的抗體做免疫印跡或者免疫熒光檢測即可。
 
 
圖3 實例:過表達(dá)基因下游帶有融合3´FLAG的載體
3、選擇標(biāo)記
選擇標(biāo)記(Selectable Markers)主要目的是區(qū)分表達(dá)于非表達(dá)目的基因的細(xì)胞。
常見的選擇標(biāo)記有Puromycin、Blasticidin、Neomycin、Hygromycin、Zeocin和各種熒光蛋白如ZsGreen、EGFP、RFP、mCherry等。
Puromycin、Neomycin、Hygromycin、Zeocin是一類可以用對應(yīng)的小分子藥物篩選的標(biāo)記;熒光蛋白標(biāo)記可以借助熒光顯微鏡直觀的觀察到表達(dá)目的基因的細(xì)胞,也可以直觀的估計感染效率等。
所以,原則是如果允許,Puromycin、Neomycin、Hygromycin、Zeocin中的一種其中一個,比如puromycin(zui常用),和熒光蛋白標(biāo)記中的任選一個,比如ZsGreen(zui常用)等。實例如圖4所示。

 
圖4 實例。此過表達(dá)載體帶有綠色熒光蛋白ZsGreen和Puromycin雙重標(biāo)記。
 
二、敲低(減、降)表達(dá)
這類載體的選擇要簡單很多,啟動子選擇U6即可。但標(biāo)記選擇通常跟過表達(dá)類似,盡量選Puromycin和ZsGreen,如圖5所示。

 
圖5 帶有ZsGreen和Blasticidin(BSD)雙重標(biāo)記的敲減型載體。
三、敲除載體
目前zui常用的就是CRISPR-Cas9的基因敲除載體,該系統(tǒng)是個二元結(jié)構(gòu),需要在同一個細(xì)胞中一起表達(dá)Cas9和針對目的基因的sgRNA。目前所用的載體有二合一的,也有分開兩個載體的。我們優(yōu)先推薦二合一型載體。
此類型的載體也是U6啟動子驅(qū)動的載體,由于Cas9體積過大,通常這類二合一載體僅會帶有一個標(biāo)記,如Puromycin或GFP,但也有人用同時帶有兩個標(biāo)記的載體。如圖6所示。

 
圖6 基于CRISPR-Cas9的基因敲除載體。我們發(fā)現(xiàn)該載體帶有ZsGreen標(biāo)記。同時Cas9C端融合FLAG標(biāo)簽。
 
注意:

  1. 對于腺病毒載體,由于其感染效率*,通常只需要帶熒光蛋白單個標(biāo)記即可,但推薦編碼蛋白的目的基因過表達(dá)時帶常見標(biāo)簽融合表達(dá);
  2. 對于在體基因功能研究,我們常用AAV載體,這類載體我們往往只需要待單個熒光蛋白標(biāo)記即可,但推薦編碼蛋白的目的基因過表達(dá)時帶常見標(biāo)簽融合表達(dá)。

 
總結(jié)
繁雜的載體類型,我們只需要按照①過表達(dá)、②敲低(減)表達(dá)、③敲除分類,按照上述原則簡單選擇目的載體即可。即使我們看不太懂質(zhì)粒圖譜也可以做出快速正確的選擇。

上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司 版權(quán)所有 地址:上海市嘉定區(qū)曹安公路5588號 郵編:201202 電話: 管理登陸
傳真:021-58999639 手機:13310162040 聯(lián)系人:俞燕熙 郵箱:m13310162040@163.com  GoogleSitemap 網(wǎng)址:kshengfa.com ICP備案號:滬ICP備14029423號-1
主營:ELISA試劑盒/染色液/溶液 /動物血清/標(biāo)準(zhǔn)品/化學(xué)試劑
點擊這里給我發(fā)消息
手機:13310162040