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shRNA 干擾實驗,你目前在哪一步?
點擊次數:10071 更新時間:2018-09-25

相信屏幕前的你,可能被 shRNA 干擾實驗困擾了無數個日日夜夜......
亦或是屢屢想嘗試,卻次次與之失之交臂......
......被困擾的你是跪在哪一步了呢?
......而止步于起點的你又是因為什么呢?


今天寫作這篇文章的目的呢,正是為幫助做實驗的你縷清思路。讓在干擾實驗門口「探頭」的你,系統的了解整個流程,從而讓入門不再只是想象。

下面我要開始放大招了:

(一)shRNA 干擾機制&shRNA 設計

shRNA(short/ small hairpin RNA)干擾機制圖解



 

shRNA 組成:

shRNA 包括兩個短的反向互補序列,中間由莖環(loop)序列分隔,組成發夾結構,隨后連上 5~6 個 T(轉錄終止信號)

手動設計,原則:

A. 首先靶位點選擇應該避開基因的非編碼區;

B. 在正義鏈和反義鏈序列上不能出現連續 3 個或以上的 T,這可能導致 shRNA 轉錄的提前終止;

C. Stratagene 發現 29 個寡核苷酸抑制目的基因表達的效率比 23 個寡核苷酸的高;

D. 在啟動子下游的酶切位點下方緊連一個 C,使插入片段和啟動子有一定空間間隔以確保轉錄的發生;

E. shRNA 目的序列的個堿基必須是 G 以確保 RNA 聚合酶轉錄。如果選擇的目的序列不以 G 開頭,必須在緊連正義鏈的上游加一個 G;

F. shRNA 插入片段中的莖環應當靠近寡核苷酸的中央,比較了眾多不同長度和序列的莖環,5'TTCAAGAGA3' 序列zui為有效;

G.  5~6 個 T 必須放置在 shRNA 插入片段尾部以確保 RNA 聚合酶III終止轉錄;

shRNA 設計好并合成之后,通過同源重組或者是酶切連接的方法進行干擾載體構建,構建成功后大量抽提質粒(去內毒素且 OD260/OD280 hao在 1.8 左右),以備轉染。

 

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