慢病毒(Lentivirus)載體是以人類免疫缺陷I型病毒為基礎發展起來的基因治療載體。區別一般的逆轉錄病毒載體,它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。在轉染遺傳物質到細胞基因組中的工作中,重組慢病毒載體是一個強大和有效的工具,該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上,從而達到持久性表達。在感染能力方面可有效地感染包括幾乎所有的哺乳動物細胞、干細胞和原代培養的細胞,目前慢病毒系統已經被廣泛應用到各種細胞系的基因過表達、RNA干擾、microRNA研究以及活體動物實驗中,從而達到良好的的基因治療效果,在美國已經開展了臨床研究,效果非常理想,因此具有廣闊的應用前景。
慢病毒轉染優點:
1.外源基因表達水平較高、表達穩定;
2.轉染效率高,可感染分裂和不分裂的細胞,幾乎可以感染所有類型的細胞,特別適合質粒載體轉染效率低的細胞;
3.慢病毒基因容易操作,易于制備大量病毒且滴度高;
4.病毒基因組可整合到細胞基因組,易于構建穩定細胞株。
慢病毒包裝技術
慢病毒表達載體包含了包裝、轉染、穩定整合所需要的遺傳信息。將外源基因克隆進入表達載體,同時與包裝質粒(表達病毒包裝所需輔助蛋白)一起轉染細胞,在細胞中進行病毒的包裝,包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養基中,收取培養基離心后可直接用于感染宿主細胞,當目的基因進入細胞后被整合到宿主基因組,從而表達目的基因。
方法一:超速離心沉淀法
1. 取6個Ultra-clear SW28離心管,用70%乙醇消毒后,放在超凈工作臺中打開紫外燈繼續消毒30分鐘。
2. 每個Ultra-clear SW28離心管中加入約32ml的預先處理的病毒上清液。
3. 取一支10ml的移液管,吸取12 ml 20%的蔗糖溶液。將移液管一直插入到離心管的底部,緩慢將蔗糖溶液打出4 ml。同樣地,將剩下8 ml的蔗糖溶液分別加入到另兩個離心管中。另取一支干凈的移液管,對剩下3管進行同樣處理。
4. 用PBS調整各管的重量,使對應的離心管之間的重量相差不超過0.1g。
5. 按次序將所有6個離心管放入Beckman SW28 超速離心轉頭中。
6. 4℃,25,000 rpm. (82,700g) 離心2小時。
7. 小心將管子從轉頭中取出。倒掉上清,將離心管倒扣在紙巾上放置10分鐘使剩余的上清流干。吸掉剩余的液滴。在管底應當有可見的沉淀。
8. 每管中加入100ml 不含鈣和鎂的PBS洗下沉淀。
9. 將SW28超速離心管插入到50ml錐底離心管中,蓋上蓋子。
10. 在4℃溶解2小時,每隔20分鐘輕輕震蕩。
11. 4℃,500g離心1分鐘,使溶液集中于管底。
12. 用200μl 移液器輕柔吹打使沉淀重懸。避免產生泡沫。將所有管中的液體集中到一個SW28離心管中。
13. 集中后的病毒懸液分裝成50μl 每份,保存在成品管中。用碎干冰速凍后儲存在-80 ℃。
方法二:依科賽慢病毒濃縮液
1. 收集上清液,3000×g離心15分鐘清除細胞和細胞碎片。
2. 將上清液轉移至無菌容器中,向4V的病毒上清液中加入1V的病毒濃縮液,4°C 孵育過夜(至少12小時)。
3. 混合液1500×g離心 30分鐘,在容器的底部可能會出現為米色或白色沉淀。
4. 吸上清,1500×g離心5分鐘,吸液去除所有的殘留液體,同時特別注意不要破壞已沉淀的病毒顆粒。
5. 用1/10 -1/100體積冷的,無菌PBS緩沖液或DMEM(含25mM HEPES緩沖液)在4℃條件下重懸病毒沉淀。
6. 分裝在預冷的小瓶中,-70℃儲存,直到使用。