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載體多克隆位點(MCS)改造步驟
點擊次數:1692 更新時間:2018-08-17

 

加、減、換一個載體 的MCS的位點 (給一個表達 載體加、減、換小表達標簽,如His6, His10,strep II等,和MCS改造是一樣的),其實技術 不是問題,問題在于位點的選擇 ,因為載體設計 時應該設計者也考慮過mcs的問題,應該給使用者越多的選擇越好,但為什么有的載體只給有限的幾個位點呢,一可能是這個載體其他部位本身含有的限制性切點比較多,因而MCS位置的選擇比較少,二就是設計者是自用的載體,沒有考慮到我們的感受 。

 

因此如果你要加、減、換MCS,可以按一下幾個步驟進行:

 

1、找到載體全序列 ,查找有沒有你想要加的位點(Primer premier5……一堆軟件 ,再不濟了用word),如果沒找到你想加、減、換的位點,恭喜了,革命要成功了;

 


2、方法上不太推薦點突變或其他以overlap PCR 為基礎的技術,推薦小片段 克隆 ,也就是做shRNA 載體的那種方法,人工合成(按引物 合成)你想要的MCS序列的正反鏈,兩端加上載體上兩個切點的粘末端序列,人工退火(95度10min,然后每分鐘降5度直至Tm值下5度,維持10min,即可),不用電泳檢驗,直接按克隆的連接體系將這個小片段與你的載體(相應酶雙切)連接轉化……

 


小片段連入的效率相當高,如果大家要檢驗:在菌長出來后,做PCR檢驗(人工合成的這個小片段的正鏈或反鏈與載體上的引物)。舉個例子:

 


比如要在某載體的EcoR I和BamH I之間加一個新的MCS(EcoR V-Kpn I-Xho I-Hind III)(這幾個位點必須在目的 載體上沒有,如果有這個切點,你又實在想用的話,可以將目的載體用這個酶單切,綠豆芽核酸 酶/s1核酸酶平端化,再自連——位點封閉):

 


1、合成 5‘-AATTC GATATC NNN GGTACC NNN CTCGAG NNN AAGCTT G-3'3'-G CTATAG NNN CCATGG NNN GAGCTC NNN TTCGAA CC TA G-5'

EcoR I粘末端  EcoRV      Kpn I                  Xho I               Hind III    BamH I粘末端 ; (這里面有幾個要點,合成時直接合成粘末端,省得再切,這樣既省合成的錢,效率又高,如果你需要在改造后的載體繼續使用原載體的連入切點,比如上面例子的EcoR I和BamH I,你像例子中一樣可以合成完整的酶切位點粘末端,如果你不想使用它們,那就只合成粘末端,比如上面那個例子,應合成5-AATT GATATC ……和3’-CTATAG ……這樣連接后,EcoR I切點就被封閉了;再有要注意考慮連入位點之間要留一定的間隔,因為靠著的兩個酶是很難雙切開的,有時候分步切都沒用,因為留給酶結合的空間太小,沒法結合l ,一般按照相鄰兩個酶的推薦保護堿基數中較大的數目留,*啊)

 

2、退火,如上;

3、克隆,同上;

4、檢驗,同上。測序,收工。

 

突變可以考慮,但如果載體太長了,做點突變越不容易,一方面比較難延伸,另一方面,即使延伸了,其他點突變的幾率也會比較大,但誰知道呢?有時候要靠一點運氣。如果想突變也是可以。

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