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常見三種質粒提取方法介紹
點擊次數:859 更新時間:2023-10-26

質粒提取主要有堿裂解法,煮沸裂解法,小量一步提取法等。

1、堿裂解法原理:根據共價閉合環狀DNA與線性DNA的拓撲學
結構差異來分離的。在強堿環境下,細菌的細胞壁和細胞膜被破壞,基因組DNA和質粒DNA被釋放出來,線性DNA雙螺旋結構被破壞而發生變性。雖然在強堿的條件下共價閉合環狀質粒DNA也會發生變性,但兩條互補鏈仍會互相盤繞,并緊密的結合在一起。當加入pH4.8的乙醋suan鉀高鹽緩沖液使pH恢復中性時,共價閉合環狀質粒DNA復性快,而線性的染色體DNA復性緩慢,細菌蛋白質、破裂的細胞壁和變性的染色體DNA會相互纏繞成大型復合物,后者被十二烷基硫酸鹽包蓋。當用鉀離子取代鈉離子時,復合物會從溶液中有效地沉淀下來,離心除去變性劑后,就可以從上清中回收復性的質粒DNA。

2、煮沸法裂解:將細菌懸浮于含Triton X-100
和能消化細胞壁的溶jun酶緩沖液中,然后加熱到100℃使其裂解。加熱除了破壞細胞壁外,還有助于解開DNA鏈的堿基配對,并使蛋白質和染色體DNA變性。但是,閉環質粒DNA彼此不會分離,這是因為他們的磷酸二酯骨架具有互相纏繞的拓撲結構,當溫度下降后,閉環DNA的堿基又各自就位,形成超螺旋分子,離心除去變性的染色體核蛋白質,就可從上清中回收質粒DNA。

煮沸裂解法
對于小于15kb的小質粒很有效,可用于提取步至lmL(小量制備),多至250mL(大量制備)菌液的質粒,并且對大多數的大腸桿菌菌株都適用。

3、小量一步提取法:由于細菌染色體DNA
比質粒大得多,受機械力后細菌染色體DNA會被震斷成不同大小的線性片段而纏繞附著在細胞碎片上,并發生變性。同樣受機械力質粒DNA會變性,機械力消失后復性。但質粒DNA的復性快,仍溶于溶液而細菌染色體DNA復性較慢,會形成不溶的網狀結構,通過高速離心可以分離得到質粒DNA 。

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