實驗方法原理
從瓊脂糖凝膠回收 DNA 是通過電泳至帶正電荷的 DEAE-纖維素膜上完成的。這種方法首先利用適當濃度的瓊脂糖凝膠電泳分離 DNA 片段,然后緊靠目的 DNA 片段條帶前方切一裂縫。將一長條 DEAE 纖維素膜插入裂縫。
實驗材料
限制性內切核酸酶DNA 樣品DNA 標準RNA
試劑、試劑盒 乙酸銨DEAE 高鹽洗脫緩沖液DEAE 低鹽洗脫緩沖液EDTA 乙醇凝膠載樣緩沖液NaOH酚氯/仿醋酸鈉TE
儀器、耗材 瓊脂糖凝膠DEAE 纖維素膜手提式長波紫外燈水浴
實驗步驟
一、材料
1. 緩沖液和溶液
乙酸銨(10 mol/L)
DEAE 高鹽洗脫緩沖液(50 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0),1 mol/L NaCI,10 mmol/L EDTA (pH 8.0))
DEAE 低鹽洗脫緩沖液(50 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0),0.15 mol/L NaCl,10 mmol/L EDTA (pH 8.0))
EDTA ( 10 mmol/L,pH 8.0)
乙醇
6X 凝膠載樣緩沖液
0.5 mol/L NaOH
酚: 氯/仿(1:1,V/V)
醋酸鈉(3 mol/L,pH 5.2)
TE ( pH 8.0)
2. 酶和緩沖液
限制性內切核酸酶
3. 凝膠
瓊脂糖凝膠,含有 0.5 μg/ml 的 EB
4. 核酸和寡聚核苷酸
DNA 樣品
DNA 標準
RNA,酵母轉運 tRNA
5. 專用設備
DEAE 纖維素膜
手提式長波紫外燈
65℃ 水浴
二、方法
1. 消化一定量 DNA 以收獲至少 100 ng 目的片段 DNA。用含有 0.5 μg/ml EB 的適當濃度的瓊脂糖凝膠電泳分離 DNA 片段。用手提式長波紫外燈對目的條帶進行定位。
2. 用鋒利的刀片或剃刀在緊靠目的條帶前的凝膠上切一切口,其兩邊比條帶寬約 2 mm。
3. 戴上手套,切一塊與切口等寬而比凝膠稍深(1 mm ) 的 DEAE 纖維素膜。在 10 mmol/L EDTA ( pH 8.0) 室溫浸泡 5 min 后,用 0.5 mol/L NaOH 取代 EDTA 浸泡以活化 DEAE 纖維素膜。再次室溫 5 min 后,用無菌水沖洗 6 次。
4. 用平頭鑷子將切口壁撐開,將膜插入裂縫中。取出鑷子,使切口閉合,小心勿留氣泡。
5. 繼續電泳(<5 V/cm) 直至 DNA 條帶遷移到膜上。電泳過程中,可以用手提式長波紫外燈(302 nm ) 進行跟蹤檢測。
6. 當所有目的 DNA 離開凝膠被收集到膜上時,切斷電流。用平頭鑷子從凝膠中取出膜,室溫下,用 5~10 ml DEAE 低鹽緩沖液將膜漂洗一下,以除去膜上的瓊脂糖。
7. 將膜轉移到另一個微量離心管中,加足量的 DEAE 高鹽洗脫緩沖液使膜wan全被浸沒。輕輕的將膜弄皺或對折,但不要壓緊。蓋上離心管蓋,于 65℃ 溫育 30 min。
8. 從膜上洗脫 DNA 的過程中,對凝膠成像,記錄被分離出的條帶。
9. 步驟 7 的液體轉移到另一微量離心管,再加入足量的 DEAE 高鹽洗脫緩沖液,于 65℃ 溫育 15 min。合并兩份 DEAE 高鹽溶液。
10. 高鹽洗脫液用酚:氯/仿抽提一次。水相轉移到另一離心管。加入 0.2 倍體積的 10 mol/L 乙酸銨,2 倍體積的 4℃ 乙醇。室溫放置 10 min。用微量離心機室溫以最大轉速離心 10 min。用 70% 乙醇小心洗沉淀。打開離心管幾分鐘,使乙醇wan全揮發。再將 DNA 重溶到 3~5 μl TE (pH 8.0)。
11. 如果需要極純的 DNA ( 如用于小鼠受精卵的顯微注射或培養細胞電穿孔),可以按照下述方法用乙醇再沉淀 DNA。
(1) 用 200 μl TE(pH 8.0)懸浮 DNA,
加入 25 μl 3 mol/L 乙酸鈉(pH 5.2),用 2 倍體積的乙醇重新沉淀 DNA。
(2) 4℃ 微量離心機最大速度離心 5~15 min, 回收 DNA。
(3) 70% 乙醇小心漂洗沉淀。打開離心管幾分鐘,使乙醇wan全揮發。將 DNA 溶于 3~5 μl TE ( pH 8.0)。
12. 通過凝膠電泳對 DNA 進行定性和定量。將少量(10~50 ng) 最終制備的 DNA 片段與 10 μl TE ( pH 8.0) 混合,加入 2 μl 所需的凝膠載樣緩沖液。加樣并在適當濃度的瓊脂糖凝膠上進行電泳,以已知量的經用適當限制酶消化的原 DNA 作為參照物標準和分子質量標準。分離的片段應該與限制酶消化產物中的相應片段同步遷移。仔細檢査凝膠,看是否有弱熒光帶存在。弱熒光帶存在表明有DNA污染。