實(shí)驗(yàn)概要
本實(shí)驗(yàn)通過免疫動(dòng)物,制備了免疫核糖核酸(iRNA),并進(jìn)行了鑒定。
實(shí)驗(yàn)原理
iRNA是用某種抗原免疫動(dòng)物后,從免疫動(dòng)物的免疫活性細(xì)胞中提取出來的RNA。它具有傳遞相應(yīng)抗原特異性免疫信息的能力,因而注入體內(nèi)后,可發(fā)揮對(duì)該抗原的免疫清除作用。
iRNA的免疫學(xué)作用機(jī)理目前尚無定論,一般認(rèn)為iRNA具有直接模板作用,即iRNA以mRNA的形式在受體細(xì)胞中起模板作用,從而合成與免疫反應(yīng)有關(guān)的蛋白質(zhì),使正常非致敏的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)變成致敏淋巴細(xì)胞。另外,也有人認(rèn)為iRNA具有逆轉(zhuǎn)錄作用、免疫調(diào)控作用及“超抗原"作用等。
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 動(dòng)物免疫
1) 抗原制備:根據(jù)欲制備的免疫核糖核酸的目的不同,采用不同的抗原。
如欲制備抗乙肝iRNA,可采用乙肝疫苗,每20μg乙肝疫苗,加1ml弗氏不wan全佐劑(液體石蠟8ml加羊毛脂2ml)及卡介苗45mg,充分混勻并乳化合格后備用。
2) 動(dòng)物選擇及免疫:大量制備時(shí),多選用綿羊或山羊,小量制備時(shí),可選用家兔或豚鼠,所用動(dòng)物應(yīng)健壯無病。免疫方法為背部及兩肘窩多點(diǎn)皮下注射上述乳化疫苗,同時(shí)腹腔注射10μg乙肝疫苗,其后每周腹腔注射20μg,共4次。
3) 效價(jià)測(cè)定及臟器采取:第4次免疫后1周,靜脈采血,分離血清,用ELISA測(cè)效價(jià),如效價(jià)在1:800以上即合格。處死動(dòng)物,采取脾臟及淋巴結(jié),置-20℃保存?zhèn)溆谩?br/>
2. iRNA的提取(熱酚法)
1) 粗提:將脾臟及淋巴結(jié)去掉結(jié)締組織及被膜,用生理鹽水洗凈,切碎,洗去血液,擠干。每200g組織加200ml鹽水,置高速組織搗碎機(jī)中制成勻漿(以8000~10 000r/min勻漿兩次,每次1~2min)。
向上述勻漿中加入苯ben酚溶液(苯ben酚1800ml加水200ml)200ml及01%SDS1000ml,混勻,置60℃水浴振蕩10min,置冰浴冷卻10min,以3500r/min離心30min,取上清液置冰浴中。
2) 精制:在上述上清中加入半量苯ben酚溶液,室溫下劇烈振蕩10min,以3500r/min離心20min,取水相。加2~3倍體積95%酒精,置冰箱(普通或低溫冰箱均可)過夜。以3500r/min離心30min,棄上清,取沉淀。取少許沉淀,溶于適量水中,測(cè)DNA含量及蛋白質(zhì),合格后可做下步。
3. 除菌、分裝及凍干
取上述沉淀,加適量三餾水溶解,取少量用紫外分光光度計(jì)測(cè)RNA含量,按測(cè)定結(jié)果,將上述溶液用三餾水稀釋至約2mg/ml。加倍量6%右旋糖酐,混勻。用微孔濾膜濾過除菌,分裝(1mg/支),凍干,封口,待檢。
4. 檢定
1) pH值,取本品2支,溶于10ml餾水中,其pH值應(yīng)為68~80。
2) 吸收度,取本品溶于餾水中,用紫外分光光度計(jì)檢測(cè),其OD260/OD280應(yīng)不小于20。
3) DNA含量測(cè)定,用標(biāo)準(zhǔn)DNA作對(duì)照,以紫外法測(cè)定,DNA含量不大于5%。
4) RNA含量測(cè)定,取本品3支,分別溶解于50ml餾水中,按《中國(guó)藥典》二部附錄法測(cè)定,三支含量均應(yīng)在095mg以上。
5) 異常毒性,取本品,以注射用生理鹽水制成05mg/ml溶液,家兔可靜脈注射,應(yīng)無異常反應(yīng)。
6) 無菌檢查,取本品3支,溶于6ml無菌水中,分別接種于普通培養(yǎng)基,厭氧培養(yǎng)基及霉菌培養(yǎng)基,培養(yǎng)1周,應(yīng)無菌生長(zhǎng)。
7) 活性測(cè)定,采用白細(xì)胞粘附抑制試驗(yàn)。其原理為正常白細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí),可粘附于玻璃表面,而用iRNA處理過的白細(xì)胞,其粘附于玻璃表面的能力則被抑制,測(cè)知該粘附抑制率,即知iRNA活性。方法為:取綿羊抗凝血,分離白細(xì)胞,將白細(xì)胞調(diào)節(jié)為在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上每大格內(nèi)含40~80個(gè)細(xì)胞的濃度。取細(xì)胞懸液,加等體積iRNA溶液,37℃水浴后,移入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板,置37℃溫育后,用鹽水沖洗、計(jì)數(shù)。同時(shí)作正常白細(xì)胞(不加iRNA)對(duì)照。計(jì)算白細(xì)胞粘附抑制率,如大于20%為合格。
注意事項(xiàng)
1. 溫度對(duì)iRNA活性影響較大。提取過程須加熱時(shí),應(yīng)嚴(yán)格控制溫度及時(shí)間。提取間歇時(shí),應(yīng)置冰浴中。
2. 嚴(yán)格控制RNA酶。RNA酶分布廣泛,如污染RNA酶可將iRNA降解而失去活性。因此,各步均應(yīng)嚴(yán)格控制,如器皿泡洗后,應(yīng)干熱滅菌,操作者應(yīng)帶手套,提取過程中,可加入RNA酶抑制劑等。
3. RNA的提取主要有熱酚法及冷酚法兩種,前者產(chǎn)率高,但易引起RNA的變性和降解;冷酚法(0~4℃)不易引起RNA的變性和降解,但產(chǎn)率較低。
4. 苯ben酚為冰狀固體,如顏色變紅,是為氧化之故,應(yīng)廢棄。ben酚加熱融化后,方可配制,配制時(shí),配制者應(yīng)注意防護(hù)。如ben酚配制后須較長(zhǎng)時(shí)間存放,應(yīng)加入8羥基喹啉以抗氧化。