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從凍存的細胞提取RNA操作步驟
點擊次數:632 更新時間:2023-07-04

從凍存的細胞提取RNA

1). 將凍存管從液氮或冰箱中取出;

2). 不待細胞溶解,將Trizol500ul-1ml直接放入凍存管中,此時Trizol會凍成冰狀;

3). 將凍存管緩慢融化,并用加樣器吹打混勻;

4). 將細胞裂解液移至Eppendorf管中,16000′g離心1min,吸出管底絮狀沉淀;

注釋:該步驟并非必要,多數Protocol省略該步驟,但加入該步中能明顯提高RNA的質量;注意不能離心時間過長,否則沉淀難以吸出,將200ul黃槍頭尖部切去0.5cm操作;

5). 加入1/5體積的氯仿(約200ul),上下顛倒2~3min;

6). 4℃ 16000′g離心15min,輕輕吸出上清至新的Eppendorf管(約700ul ),不要擾動中間層或用手指使Eppendorf管變溫;

注釋:一般情況下提取的RNA已經足夠,而且在逆轉錄過程中RNA的質量要遠較RNA的數量更重要,一般僅取上清的上1/2左右足矣,這樣可最大限度避免對于中間蛋白相的擾動;

7). 加入等體積異丙醇(約800ul),充分混勻,冰上靜置15min;

8). 4℃ 16000′g離心15min,輕輕倒掉上清,僅留管底沉淀;

9). 加入1ml預冷的無水乙醇,4℃ 16000′g離心2min,輕輕倒掉上清,僅留管底沉淀;

10). 倒置Eppendorf管于干凈濾紙上,至可見乙醇wan全揮發;

11). 用100ul 新鮮制備的DEPC處理過的MilliQ 水溶解RNA,如果溶解不好,-20℃反復凍融1~2次,4℃ 16000′g離心3min,將上清吸至新的Eppendorf管中;

12). 加入等體積12 M LiCl,-20℃靜置15min;

13). 4℃ 16000′g離心15min,輕輕倒掉上清,僅留管底沉淀;

注釋:該步驟的目的在于去除小分子降解RNA和鹽分;但可以省略;只有大分子RNA在高濃度LiCl中沉淀,DNA不會沉淀;

14). 加入1ml預冷的無水乙醇,4℃ 16000′g離心2min,輕輕倒掉上清,僅留管底沉淀;

注釋:該步的目的在于去除LiCl,LiCl溶于乙醇,而RNA不溶于乙醇,利用溶解度分離;

15). 倒置Eppendorf管于干凈濾紙上,至可見乙醇wan全揮發RNA邊緣呈半透明;

16). 用40ul新鮮制備的DEPC處理過的MilliQ 水溶解RNA;

17). 取出5ul 用于紫外分光光度計測定和瓊脂糖凝膠電泳,其余凍存-70℃。

注釋:如果OD260/OD280<1.8,則加入等體積Trizol,按上述步驟重新提純。

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