一、實驗器具與材料:
1、移液槍:1ml、200μl、20μl、10μl、2μl
2、吸頭:1ml、200μl、20μl
3、勻漿管:5ml
4、吸頭臺:放置1ml吸頭的一個,放置20μl吸頭的一個
5、EP管:1.5ml、0.2ml、100μl
6、試劑瓶:2個60ml的棕色試劑瓶(廣口,帶蓋);1個125ml的白色試劑瓶(放無水乙醇)
7、量筒:50ml、250ml、500ml
8、容量瓶:250ml、500ml、1000ml
9、試管架:5ml、1.5ml、20μl
10、鹽水瓶:250ml、500ml各2個備用,一個裝無水乙醇,另一個裝DEPC水
11、鋁制飯盒:4個
12、塑料小飯盒:1個
13、大瓷缸:2個
14、錫泊紙:一卷
15、卷紙:2卷
16、三角燒瓶:帶蓋,稍大
二、實驗器具的處理與準備
1、塑料制品:(包括槍頭、EP管、勻漿管等)
先將DEPC水從容量瓶中倒入瓷缸中,將塑料制品逐個浸泡其中,其中小槍頭需要吸管打入DEPC水,過夜,然后高壓,再烤干備用,實驗前將槍頭等放入吸頭臺,再高壓一次(EP管)
2、玻璃制品:泡酸過夜,沖洗干凈,蒙錫紙烤干備用(DEPC水泡)(洗凈后先泡1‰DEPC過夜,再烤干)
3、勻漿器:(包括剪刀、鑷子)先洗凈后,再高壓(不需要泡DEPC)
三、試劑配制:
1、DEPC水:吸出1ml放在1000ml雙蒸水中配成1‰DEPC水,放在1000ml容量瓶中靜置4小時備用。
2、75%乙醇:用無水乙醇 DEPC水配,然后放-20℃保存(其中DEPC水需先高壓)
3、異丙醇:放入棕色瓶中
4、氯仿:放入棕色瓶中
5、瓊脂糖
四、幾種緩沖液的配制:
1、電泳緩沖液:
Tris 54g
硼酸 27.5g
0.5M EDTA 20ml pH8.0
蒸溜水 1000ml
5×TBE (貯存液)
再將5×TBE稀釋10倍成0.5TBE就可以在電泳時使用(即工作液濃度),如取50ml貯存液 450ml水--→500ml工作緩沖液
2、上樣緩沖液:
0.25%溴酚藍
0.25%二甲苯青FF
30%甘油
6×緩沖液,4℃保存
五、瓊脂糖凝膠的配制:
1、1.0%: 1.0g瓊脂糖 100ml電泳緩沖液,微波爐中火30秒至沸騰,熔化的瓊脂物冷卻至60℃時加入10mg/ml溴化乙錠2.5μl,充分混勻,將溫熱的凝膠倒入已置好梳子的膠膜中,在室溫下放置30-45min后現(xiàn)進行電泳。
2、1.5%: 同上,將瓊脂糖的量改為1.5g
六、需購置的Rt-PCR材料:
Taq酶(含MgCl2 Buffer) 200u 70.00
dNTP: 1支
oligo(dT)15: 1 OD 40.00 promega
M-MLV: 1支 250.00 promega (Buffer)
RNasin: 1支 110
-- -20℃
DEPC 5g 110.00
Trizol 100ml/1瓶 Invitrogen Life technologies
-- 4℃
Marker: 10μg 0.2μg/ml 150.00
七、引物合成
1. 正義:5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′
反義:5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′
2、par-4:
正義:5′-GGGACCTCGGAACTCAAC-3′
反義:5′-TGTATCTGCCTGGGACTG-3′
3、退火溫度計算:
2(A T) 4(G C)
正反義平均數(shù),再上下波動度(±4℃,或±5℃)
4、引物各合成5 OD,每OD一瓶分裝好
5、引物稀釋:
加DEPC水量為(μl)= ? nmol / OD × 管上所標OD數(shù)×100
是為10p mol / μl 濃度的引物溶液
八、PCR產(chǎn)物電泳
先將1-10μl左右PCR產(chǎn)物,加已點在紙上的溴酸蘭,反復吸打混勻后進行電泳,一般電流為10mA,電源100V,電泳30分鐘,紫外燈下觀察,滿意的結果掃描打印。
九、幾個注意點:
1、逆轉錄的關鍵步驟是立即冰水浴。
2、Rt時,先打開PCR預熱30分鐘。
3、RNA抽提前,打開離心機預冷。