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PCR產物的兩種檢測方法介紹
點擊次數:292 更新時間:2023-05-30

PCR產物的檢測方法:

瓊脂糖凝膠電泳

這是實驗室最chang用的方法,簡便易行,只需少量DNA即可進行實驗。其原理是不同大小的DNA分子通過瓊脂糖凝膠時,由于泳動速度不同而被分離,經溴化乙錠(EB)染色,在紫外光照射下DNA分子發出熒光而判定其分子的大小。

用于電泳檢測PCR產物的瓊脂糖濃度常為1%—2%,應該使用純度高的電泳純級瓊脂糖,這種瓊脂糖已除去了熒光抑制劑及核酸酶等雜質。

(1)制膠

瓊脂糖凝膠厚度約為3~5mm。過薄則加樣孔樣品會溢出來,過厚觀察時熒光穿透不強以至有些小片段DNA帶型不易分辨。如配制2%凝膠100ml,稱取瓊脂糖2g于三角瓶中,加入100ml 0.5×TBE液,微波爐加熱2-5min,使瓊脂糖wan全溶解(注意不要暴沸),置室溫等溫度下降至60℃時,加入終濃度0.5μg/ml的EB液,充分混勻后倒板(注意排除氣體)。

(2)加樣和電泳

上樣時一般取PCR反應液5~10μl,加入3μl溴酚蘭液,充分混勻,加入凝膠加樣孔中。電泳儀可用一般穩壓可調中壓電泳儀,電泳工作液為0.5×TBE液,接通電源,使樣品由負極向正極移動。60-100V恒壓電泳約30-60分鐘。

(3)檢測

將凝膠板放在紫外透射儀的石英玻璃臺上進行檢測,DNA產物與熒光染料EB形成橙黃色熒光復合物。觀察各泳道是否有橙黃色熒光帶出現,并與擴增時所設的陽性對照比較,判斷陽性或陰性結果。也可在電泳時以標準分子量作對照,判斷其擴增片段是否與設計的大小相一致。

聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖凝膠電泳繁瑣,但在引物純化、PCR擴增指紋圖、多重PCR擴增、PCR擴增產物的酶切限制性長度多態性分析時常用到。

聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨DNA片段的有效范圍:

(1)制膠

在兩塊制膠玻璃板中間放上墊片,放上制膠架,擰緊制膠螺絲夾緊玻璃板。

制備適量合適濃度的凝膠,使之略多于膠板。

不同濃度(%)聚丙酰胺凝膠的制法:

在加入TEMED和10%過硫酸銨后,立即混勻,倒入放置45℃角的玻璃板內,wan全注滿(注意不要有氣泡),迅速將玻璃板放置水平位置。立即放成型梳子于腔頂并夾緊,待30-60分鐘膠聚合后,取下膠板,放入電泳槽中固定。

(2)加樣和電泳

上下槽中加入1×TBE電泳緩沖液,溢過加樣孔,拔出梳子,排出加樣孔中的氣泡,將PCR產物或限制性內切酶消化產物2與1上樣緩沖液混勻,用微量注射器加入加樣孔底部,使樣品在孔底成一層,兩側孔中加入標準分子量的DNA Marker。

以2-10V/cm電壓電泳,電泳時間足夠長,使片斷足以分開,待指示劑走到適宜位置時關閉電源,將膠片取出。

(3)銀染

分開兩塊玻璃板,將凝膠片放入100ml銀染固定液中振蕩15min,雙蒸水洗3次,每次2min,然后將凝膠片轉入100ml 0.2%的AgNO3中于搖床上染色約10min,吸去AgNO3液,用雙蒸水洗3次,每次30s,加入100ml顯色液約7-10min,待DNA帶顯示清除時,吸去顯色液,加入固定液Na2CO3,靜置2-3min,取出凝膠觀察。

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