一、實驗步驟:
(1)樣品制備:對于貼壁生長細胞,yi酶消化,調整細胞濃度約1×105/ml,滴加于蓋玻片上(置于6孔板中),培養相應時間后,取出細胞爬片,用PBS 洗滌3次。
(2)樣品固定:95%乙醇固定20min,PBS洗滌2次,每次1min。
(3)染核:蘇木素染液染色2-3min,自來水洗滌。
(4)分色:鏡下觀察,若細胞核染色過深,用1%鹽酸酒精溶液分色數秒,自來水洗滌。
(5)染胞質:浸入伊紅染液染色1min,自來水洗滌。
(6)吹干或自然晾干細胞 爬片后,中性樹膠封片。
若細胞用4%多聚甲醛固定,則染色時間相應延長,蘇木素染色12-15min,伊紅5min即可。
二、注意事項:
1、染色時調節pH值很重要。如果組織塊在福爾馬林中固定時間長,組織酸化而影響細胞核著色。因此,要在自來水中沖洗時間長一些或在飽和碳酸li水溶液中處理10-30min,這樣可以使細胞核著色較深。染伊紅時胞漿著色不佳,可在伊紅溶液中滴加1-2滴冰醋酸。
2、切片染蘇木精后,分色這一步是關鍵,應在顯微鏡下控制進行,一般以細胞核染色清楚(晰)而細胞質基本無色為佳。如果過分延長分色時間將導致染色太淺,應重新染色后再行分色。
3、切片經酒精脫水后,入二甲苯時可出現白色不透明狀態,此為脫水不徹di,應將切片退回wu水酒精,更換酒精、二甲苯,以求徹di脫水與透明。
4、在染色過程中不要讓切片干燥,以免切片收縮、變形,影響神經元形態。
5、切片從二甲苯取出或進入二甲苯前,切片周邊均應擦干凈或吸干多余水分。
6、最后封固時,要用中性樹脂,防止日后褪色,蓋片要選大于組織塊的面積,如漏出一部分不久將會褪色,所用樹脂濃度要適當,樹脂封固時不能有氣泡。