要獲得微生物純培養,必須避免雜菌污染,因此對所用器材及工作場所進行消毒與滅菌。對培養基而言,更是要進行嚴格的滅菌。對培養基一般采取高壓蒸汽滅菌,一般培養基用1.05kg/cm2,121.3℃條件下維持15-30min可達到滅菌目的。在高壓蒸汽滅菌過程中,長時間高溫會使某些不耐熱物質遭到破壞,如使糖類物質形成氨基糖、焦糖,因此含糖培養基常在0.56kg/ cm2,112.6℃15-30分鐘進行滅菌,某些對糖類要求較高的培養基,可先將糖進行過濾除菌或間歇滅菌,再與其他已滅菌的成分混合;長時間高溫還會引起磷酸鹽、碳酸鹽與某些陽離子(特別是鈣、鎂、鐵離子)結合形成難溶性復合物而產生沉淀,因此,在配制用于觀察和定量測定微生物生長狀況的合成培養基時,常需在培養基中加入少量螯合劑,避免培養基中產生沉淀,常用的螯合劑為乙二胺四乙酸(EDTA)。還可以將含鈣、鎂、鐵等離子的成分與磷酸鹽、碳酸鹽分別進行滅菌,然后再混合,避免形成沉淀;高壓蒸汽滅菌后,培養基pH會發生改變(一般使pH降低),可根據所培養微生物的要求,在培養基滅菌前后加以調整。
在配制培養基過程中,泡沫的存在對滅菌處理極不利,因為泡沫中的空氣形成隔熱層,使泡沫中微生物難以被殺死。因而有時需要在培養基中加入消泡沫劑以減少泡沫的產生,或適當提高滅菌溫度。
培養基的滅菌方法
1、高壓蒸汽滅菌:
高壓蒸汽滅菌適合于耐高溫培養基、接種器械和蒸餾水的滅菌。培養基在愛制備過程中混入各種雜菌,分裝后應立即滅菌,至少應在24h內完成滅菌工作。滅菌時一般是在0.105MPa壓力下,溫度121℃時,滅菌15~30min即可。消毒時間不宜過長,也不能超過規定的壓力范圍,否則有機物質特別是維生素類物質就會在高溫下分解,失去營養作用,也會使培養基變質、變色,甚至難以凝固。將蒸餾水或自來水裝在三角瓶中,裝水量一般不超過瓶的2/3,用牛皮紙或硫酸紙包扎封口,然后放入高壓鍋中滅菌后即為無菌水。 滅菌后的培養基可放到培養室中預培養3d,若無污染現象,則證明滅菌是徹di的,可以使用。暫時不用的培養基最好置于10℃下保存。含IAA或GA3的培養基應在1周內用完,其他培養基最多也不要超過1個月。
2、過濾滅菌:
一些植物生長調節劑及有機物,如IAA、GA3、ZT、CM等,遇熱容易分解,不能與培養基一起進行高溫滅菌,而要使用細菌過濾器濾去其中的雜菌。細菌過濾器與濾膜(孔徑0.45微米)使用之前要先進行高壓滅菌。過濾后的溶液要立即加入培養基中,若為液體培養基,可在培養基冷卻至30℃時加入;若為固體培養基,必須在培養基凝固之前(50-60℃)加入,振蕩使溶液與其他成分混合均勻。