做過(guò)分子實(shí)驗(yàn)的人都知道，要想做的有效率有質(zhì)量是很困難的，1 個(gè)月做 100 個(gè)克隆那都是 小 case，沒(méi)點(diǎn)看家的本事怎么行。如果再遇到比較稀有的基因，周旋個(gè)把月，那也是家常便飯。下面遠(yuǎn)慕生物就和大家分享一些載體構(gòu)建的經(jīng)驗(yàn)，從此邁向科研達(dá)人！

1. 準(zhǔn)備工作

俗話(huà)說(shuō)：用欲善其事，必先利其器。建議大家在做構(gòu)建之前先找好工具，效果事半功倍哦。 推薦兩個(gè)工具，一個(gè)是 oligo 軟件，常用于引物設(shè)計(jì)和酶切位點(diǎn)分析；另一個(gè)是 DNAstar 軟件，工具ji強(qiáng)大，一款全面的生物醫(yī)學(xué)軟件，用作 DNA 和蛋白質(zhì)序列分析、重疊群拼接和基因工程管理。

2. 設(shè)計(jì)引物

1) 注重要：看懂質(zhì)粒圖譜！拿大家比較熟悉的 PEGFP-C1 和 PEGFP-N1 做例子。 想用 N1 質(zhì)粒，設(shè)計(jì)引物就得把下游引物上的中止密碼子去掉，不要辛辛苦苦的一路做下來(lái) 結(jié)果根本不表達(dá)融合蛋白，你就死了；C1 質(zhì)粒，注意閱讀框，要是移碼了，你也死了。而且 139PEGFP 系列有 1.2.3，要弄清楚別弄竄了。一句話(huà)，要看懂你的圖譜！

其他需要注意：

*設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)時(shí)要加保護(hù)堿基（大家要用 T 載體就當(dāng)我沒(méi)說(shuō)）;

*酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)原則：盡量用粘性末端，實(shí)在不行就用一些常用平端酶，如 EcoRV 和 SnaB1 等，要是以后還有別的用處就多加點(diǎn)酶切位點(diǎn)，曾一口氣在引物上加了五個(gè)酶切位點(diǎn)以防以后要用到，注意計(jì)算 TM 值的時(shí)候要減去這些不匹配的序列；

*注意 KOZAK 序列的問(wèn)題，很多質(zhì)粒沒(méi)有提供 KOZAK 序列，這要在設(shè)計(jì)的時(shí)候直接在引物上加好。

*擅用 Gene Overlap，比方說(shuō)加個(gè) flag 標(biāo)簽，his 標(biāo)簽，my 標(biāo)簽之類(lèi)的，直接設(shè)計(jì)三引物 overlap 一下就可以，省得還要再多構(gòu)建一步，這些都是設(shè)計(jì)引物時(shí)候就要考慮好的。引物長(zhǎng)一點(diǎn)不要緊（兩步法），尤其是對(duì) GC 比高的序列，有時(shí)候引物不長(zhǎng) PCR 根本不出結(jié)果，注意如果 GC 比較高，這個(gè)時(shí)候 Gene Overlap 就不要做了，很麻煩，克隆很難挑。

*沒(méi)有合適的酶切位點(diǎn)？很簡(jiǎn)單，用同尾酶策略，比方說(shuō) Bgl2 和 BamH1，Nhe1 和 spe1，Xho1 和 Sal1（注意連上了切不下來(lái)），實(shí)在不行就平端吧。

3. PCR 擴(kuò)增

如果沒(méi)有現(xiàn)成的質(zhì)粒可供酶切，PCR 是很理想也是很方便的策略。目前市面上可選擇的 PCR 酶實(shí)在太多，每隔一段時(shí)間還會(huì)升級(jí)，正常情況下，高保真的 taq 酶都能滿(mǎn)足需求。但如果遇到難 PCR 的高 GC 基因，可以換不同 PCR 酶，添加一些 DMSO，甘油等，實(shí)在不行可以考慮 Clontech 的 2 GC rich kit，價(jià)格和實(shí)力都大牛。另外，建議電泳切膠回收純化 PCR 產(chǎn)物， 去除一些非特異性條帶。

4. 酶切

強(qiáng)烈推薦 NEB 的內(nèi)切酶，記得有一次用別家的酶切過(guò)夜，結(jié)果質(zhì)粒都被切碎了（當(dāng)然當(dāng)時(shí)質(zhì)粒濃度也不高），而用 NEB 的酶，切個(gè)七十二小時(shí)仍舊一切 OK，尤其現(xiàn)在 NEB 還推出了 HF 的內(nèi)切酶，沒(méi)有星活性而且統(tǒng)一都用 Buffer4。另外 TAKARA 的酶也還可以。

5. 連接

常用的是 NEB 的 T4 連接酶，很好用，但是注意 Buffer 里有 ATP，反復(fù)凍融 ATP 失活很快， 拿到 buffer 后就分裝，10uL/管，一次性使用。

載體總量：一般來(lái)說(shuō)，載體濃度在 20-100ng/uL 較好，太低的話(huà)碰撞幾率低，太高的話(huà)又會(huì)產(chǎn)生很多非目的克隆，總量從 50-100ng 就可以，太低失敗幾率很高，太高克隆太多，挑克隆會(huì)很麻煩，反應(yīng)總體積也有講究，體積太大載體和目的片段碰撞幾率太低，而且對(duì)感受態(tài)細(xì)胞也是個(gè)挑戰(zhàn)，通用 10-15uL。

載體和插入片段比例：載體和插入片段比例一般是 1:7，如果很難連接，比如說(shuō)平端連接，要適當(dāng)提高片段濃度，同時(shí)加大比例 1:10。

6. 轉(zhuǎn)化

按照 SOP 做就行，話(huà)說(shuō)實(shí)驗(yàn)室原來(lái)從 takara 買(mǎi)感受態(tài)（competent cell），后來(lái)發(fā)現(xiàn)還是自己做的效率高（protocol 免費(fèi)索取）。要注意的是 LB 必須無(wú)菌而且沒(méi)有抗生素。

7. 鑒定

想要快速鑒定，建議用菌液 PCR，菌液 PCR 是有一定講究的，很多人做菌液 PCR 鑒定假陽(yáng)性特多，為什么？因?yàn)槟?PCR 引物選的都在載體上，注意引物必須分別在載體和插入片段上才準(zhǔn)，PCR 方法鑒定是極其準(zhǔn)確的，數(shù)百次菌液 PCR 經(jīng)驗(yàn)。PCR 鑒定做起來(lái)也很簡(jiǎn)單， 拿個(gè) 2mL tube，裝 0.5mL 加入相應(yīng)抗生素的 LB，搖個(gè)三小時(shí)左后取 1uL 做模板就行了。如果想更快，直接菌落 PCR 也不錯(cuò)，效果一樣。

8. 測(cè)序

拿到測(cè)序結(jié)果時(shí)，不僅要核對(duì)序列，還要看測(cè)序峰圖，這很重要。因?yàn)橛袝r(shí)候光看序列對(duì)，實(shí)際上圖顯示的不對(duì)，或者雖然序列結(jié)果不對(duì)，但是圖上出現(xiàn)的峰值本身就很怪異不可信，出現(xiàn)突變也不怕，有很大可能性是簡(jiǎn)并密碼子；還要重點(diǎn)檢查的地方就是“接頭"的地方，因?yàn)榕紶栆飼?huì)出錯(cuò)，比方說(shuō)少個(gè)堿基什么的，還有時(shí)候酶切之后連接也會(huì)丟一兩個(gè)堿基什么的，如果不仔細(xì)檢查到了后期悔之無(wú)及。