實(shí)驗(yàn)原理:過(guò)氧化物酶催化以下反應(yīng):2 H2O2 →O2+2H2O
這一類(lèi)酶以鐵卟啉為輔基,所以屬血紅素蛋白質(zhì)類(lèi)(hemeProteins)。過(guò)氧化物酶在生物界分布極廣,在細(xì)胞代謝的氧化還原過(guò)程中起重要的作用。
本實(shí)驗(yàn)是以辣根為原料,經(jīng)過(guò)水的抽提,硫酸銨和丙酮分級(jí)分離,再經(jīng)鋅離子純化,透析除鹽,冷凍干燥,最后制得高純度的辣根過(guò)氧化物酶。
辣根過(guò)氧化物酶分子量在40,000左右,是一種含亞鐵血紅素的蛋白質(zhì),等電點(diǎn)7.2;易溶于水,溶解度為5%(W/V),溶液呈棕紅色,透明;也溶于0.58飽和度以下的硫酸銨溶液,而0.62飽和度以上則不溶。該酶最適pH為7.0(對(duì)愈創(chuàng)木酚為氫給體而言)。在室溫下HRP在幾周內(nèi)保持穩(wěn)定,加熱到63℃后15分鐘內(nèi)穩(wěn)定。
辣根過(guò)氧化物酶氧化還原電勢(shì)很低,pH6.08時(shí),E’0= -0.2070V;pH為7.71時(shí),E’0= -0.5787V。
辣根過(guò)氧化物酶的作用機(jī)理可分以下三步:
第一步,形成綠色有活性的酶一底物復(fù)合物Ⅰ:
第二步,復(fù)合物Ⅰ轉(zhuǎn)變成紅色有活性的復(fù)合物Ⅱ:復(fù)合物Ⅰ+AH→復(fù)合物Ⅱ+A
第三步,復(fù)合物Ⅱ被還原,釋放出酶:AH:表示還原型氫供體。
在一定程度上復(fù)合物Ⅱ可自發(fā)地分解成HRP和產(chǎn)物(P),亦可與過(guò)量的過(guò)氧化氫形成無(wú)活性的復(fù)合物Ⅲ。復(fù)合物Ⅱ自發(fā)地分解
辣根過(guò)氧化物酶的活力測(cè)定方法有多種,主要原理介紹如下:
復(fù)合物Ⅱ與過(guò)量的過(guò)氧化氫形成復(fù)合物Ⅲ
1、Rz值,提純工作的后幾步以及純酶溶液可用Rz值表明酶的純度。Rz值403nm處的吸收代表血紅素輔基的吸收,275nm的吸收是蛋白質(zhì)的吸收,結(jié)晶的HRP的Rz值為3.04。測(cè)定時(shí)的酶濃度為1毫克蛋白/毫升。
2、愈創(chuàng)木酚法:測(cè)k4[見(jiàn)反應(yīng)式⑶]。以愈創(chuàng)木酚(鄰甲氧基酚,guaiacol)為氫給體,其反應(yīng)如下:
愈創(chuàng)木酚法
四鄰甲氧基連酚有色產(chǎn)物四鄰甲氧基連酚(E470nm = 26.6mM-1·cm-1)生成的速度(dx/dt)與底物過(guò)氧化氫以及氫供體愈創(chuàng)木酚的濃度有關(guān)。方程如下:
生成的速度
e—酶濃度;α0—?dú)涔w起始濃度;x0為過(guò)氧化氫的起始濃度。
如果測(cè)定的條件選擇成k4α0>>k1x0,可以測(cè)得k1:
生成的速度
所以:
K1K1—測(cè)定過(guò)程中底物減少的速度。
本實(shí)驗(yàn)是采用測(cè)定k4的方法來(lái)判斷酶的純度。
上述測(cè)定Rz值和k4值的方法雖然比較簡(jiǎn)單,但都不能測(cè)得酶的實(shí)際活力單位。測(cè)定過(guò)氧化物酶的傳統(tǒng)方法是連苯三酚試驗(yàn)法,以過(guò)氧化氫為底物,在酶作用下,連苯三酚可形成紅棓酚(Purpurogallin),在430nm處測(cè)定產(chǎn)物的形成。用紅棓酚值(PZ)表示酶的活力。PZ表示在標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定條件下1毫克酶所形成的紅棓酚微克數(shù)。
儀器和試劑
儀器:離心機(jī)、干燥器、分光光度計(jì)。
試劑
⒈. 硫酸銨:工業(yè)純和化學(xué)純;
⒉. 丙酮。
⒊. 10mM pH7.0磷酸鹽緩沖液:稱(chēng)取243.5毫克磷酸2氫鈉(NaH2PO4·2H2O)和857毫克磷酸氫2鈉(Na2HPO4·12H2O),溶于400毫升水中。
⒋. 20mM愈創(chuàng)木酚溶液:取0.22毫升愈創(chuàng)木酚加水至100毫升。
⒌. 40mM過(guò)氧化qing溶液:取0.4毫升30%過(guò)氧化氫加水至100毫升(如測(cè)k1則用10mM過(guò)氧化qing溶液)。臨用前配制。
⒍. 5%乙酸鋇溶液
7. 奈氏試劑
⒏. 0.1 mol/Lxiao酸銀溶液
操作步驟
(一)HRP的制備
⒈水提取:
稱(chēng)取 10斤用水沖刷干凈的鮮辣根(辣根皮中亦含有豐富的HRP),用菜刀切成小碎塊,在攪肉機(jī)中攪碎1~2次。碎渣漿用1倍體積的水在低溫下攪拌提取過(guò)夜(亦可采用高速抽提法)。次日用甩干機(jī)(或離心機(jī))甩干,收集濾液,碎渣再用1/4倍體積水浸泡提取一次,合并兩次濾液,量總體積和度,0。
⒉硫酸銨分級(jí)分離:
在不斷攪拌下,每升濾液中慢慢加入226克硫酸銨粉末(相當(dāng)于0.40飽和度),大約在1~2小時(shí)內(nèi)加完,置冷室中放置過(guò)夜。次日將上清液小心地用虹吸管移出,下面渾濁液以3000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘,棄沉淀,合并上清液。再按每升上清液加258克硫酸銨粉末(0.8飽和度)隨加隨攪拌,當(dāng)硫酸銨全部溶解后,置冷室過(guò)夜。次日,虹吸出上清液,沉淀部分在冰凍離心機(jī)中以13000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘,棄去上清液,收集沉淀。將沉淀懸浮于100~150毫升蒸餾水中(加水量要使沉淀全部溶解為止),分裝于透析袋內(nèi),放在流動(dòng)自來(lái)水中進(jìn)行透析1~2天,直到硫酸銨透析完畢為止(可用5%乙酸鋇溶液或奈氏試劑進(jìn)行檢查)。然后改換成用蒸餾水透析,中間更換2~3次,用0.1 mol/Lxiao酸銀溶液檢查透析外液無(wú)氯離子為止。
將透析液合并,在冰凍離心機(jī)中以 4000轉(zhuǎn)/分離心 15分鐘;去沉淀,量上清液的體積。
⒊丙酮分級(jí)分離:
將上清液倒入燒杯并置冰鹽浴中,在不斷攪拌下,用細(xì)滴管沿杯壁加入1倍體積預(yù)冷至-15℃的丙酮,放置片刻,在冰凍離心機(jī)中以4,000/分離心15分鐘,棄去沉淀。上清液再加入0.8體積(按原上清液體積)-15℃丙酮,(操作同上),靜置后,在冰凍離心機(jī)中離心收集沉淀。將沉淀溶于少量蒸餾水中,透析除丙酮??傻肦z值近于1的酶溶液。
⒋精制:
將上步酶液適當(dāng)稀釋?zhuān)渭?M硫酸鋅溶液,使酶液中鋅離子濃度為10-3M,5000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘,得上清液。再將沉淀用少量蒸餾水洗滌,離心,洗液與清液合并,分裝于透析袋內(nèi),對(duì)水透析除鹽,用微孔濾膜過(guò)濾,進(jìn)行真空冷凍干燥(約得20毫克),產(chǎn)品呈米黃色纖維狀松軟物,HRP產(chǎn)品的Rz值可達(dá)3.0左右,置真空干燥器中低溫保存。
(二)HRP的活力測(cè)定
⒈活力測(cè)定:測(cè)定k4值的方法操作如下:
取2個(gè)比色池(帶蓋,光程1厘米),加入反應(yīng)物
酶液
*酶液:將1毫克蛋白/毫升的酶液用磷酸鹽緩沖液稀釋10倍后應(yīng)用。
加好反應(yīng)物,搖勻,在470nm 讀出OD值,為t=0 的讀數(shù)。立即加0.01毫升40mM過(guò)yang化氫溶液于2個(gè)比色池中,即刻搖勻并記時(shí),每隔30秒鐘讀數(shù)一次,約5分鐘。并記下實(shí)驗(yàn)時(shí)的室溫。
將所測(cè)樣品的OD值減去相應(yīng)時(shí)間對(duì)照的OD值,然后以O(shè)D值為縱坐標(biāo),時(shí)間為橫坐標(biāo)作圖。得一直線,計(jì)算出平均每分鐘光密度的增加值,即求出△x/△t,按公式⑻求出k4值。實(shí)際的實(shí)驗(yàn)值k4 = 2.2×10,k4 = 3.1×10,而k4 應(yīng)當(dāng)為3.3×10。該方法用于測(cè)定粗的無(wú)細(xì)胞提取液誤差較大。
因?yàn)槟承┪镔|(zhì)可干擾四鄰甲氧基連酚的形成。或不求k4值,而把在上述條件下,每分鐘OD470增加0.001所需酶量定為1個(gè)HRP活力單位。
⒉蛋白質(zhì)含量的測(cè)定:
將酶液適當(dāng)稀釋后,用 Folin一酚試劑法比色測(cè)定蛋白質(zhì)含量。