實驗材料 昆蟲

試劑、試劑盒 胎牛血清 臺盼藍 乙醇

儀器、耗材 培養瓶 培養箱

細胞計數器 攪拌臺 轉子 離心機

實驗步驟

1.  將4 ml 含10%胎牛血清的wan全昆蟲細胞培養基加入一個25 cm2 培養瓶。取出一支凍存Sf9細胞的安瓿，迅速置于37℃水浴，用手前后劇烈搖動融化之，當安瓿的內容物幾乎wan全融化時，將安瓿浸入70%乙醇，消毒外壁。

2.  打碎安瓿頸部，將內容物轉移至25 cm2 培養瓶，用手輕輕搖動培養瓶，使細胞分散均勻，于27℃溫育2~3 h 直到細胞貼壁。

3.  除去舊培養液，換5 ml 含10%胎牛血清的新鮮wan全培養液。繼續溫育，每3天換液一次，直到細胞生長匯片。

4.  準備一個新的25 cm2 培養瓶，加入4 ml 含10%胎牛血清的wan全培養液

5.  當Sf9細胞已生長匯片時，棄去培養瓶中的培養液。加入新鮮的wan全培養液，用移液管輕柔吹打或用手掌輕拍培養瓶，重懸細胞。

6.  用為培養組織細胞所設計的血細胞計數器計數細胞，在25 cm2 培養瓶中接種1×106~2×106個細胞，搖動培養瓶使細胞均勻分布。于27℃溫育，每3天用含10%FBS的wan全培養基換液，直到培養瓶中的細胞生長匯片。

7.  棄去匯片的單層培養細胞中的培養液，并重懸細胞。

8.  用血細胞計數器計數細胞。以約4×105~5×105細胞/ml 的密度將細胞接種于一個旋轉培養瓶中。于27℃溫育，以60~80 r/min 的速度恒速攪拌。輕微開啟旁邊的通氣孔，以保證充足的空氣。

9.  每隔2~3天進行細胞計數，當細胞密度達到2×106~2×106細胞/ml 時進行傳代， 將適量細胞移至一個含有新鮮wan全培養液的新培養瓶中，使終密度達到4×105~5×105細胞/ml。或者，倒出適當體枳的細胞懸液，代之以新鮮培養液。

10.  加入0.1 ml 的0.4%臺盼藍于1 ml 對數生長的細胞中，確定細胞活力。在低倍顯微鏡下檢査細胞，計數被臺盼藍染色的細胞（死細胞），并計算總細胞數。

11.  將細胞傳代至1份wan全培養液/10%胎牛血請清和1份無血清培養液混合的液體中。讓細胞長至匯片（單層培養），或達到2×106~3×106細胞/ml 的密度（懸浮培養）。

12.  將細胞傳代至含胎牛血清wan全培養液與無血清培養液比例為1：4的混合液中，讓細胞生長。

13.  用wan全培養液與無血清培養液比例為1：8至1：10的混合液，重復細胞傳代與細胞生長的步驟。

14.  用無血清培養液傳代細胞。

15.  計數呈指數生長的待凍存細胞，于室溫以1 000g 離心10 min，棄去上清液。

16.  用含10%胎牛血清的wan全培養液以1×107~2×107細胞/ml 的密度重懸細胞團塊。 加入等體積含10%胎牛血清和20%DMSO的wan全培養液，將細胞置于冰浴。吸出 1 ml 細胞移入帶螺口蓋的凍存管中，于-20℃保存2 h，然后于-70℃過夜。

17.  將凍結的細胞移至液氮罐中以便長期保存。