RNA核酸外切酶
Terminator 5'-Phosphate-Dependent Exonuclease
Terminator Exonuclease是一種5’→ 3’進(jìn)行性核酸外切酶,可降解帶有5’單磷酸的RNA。它不會(huì)降解具有5’三磷酸、5’-帽結(jié)構(gòu)(例如大多數(shù)真核mRNA帶有的5’-帽結(jié)構(gòu))或5’OH的RNA。它也消化帶有5’單磷酸的DNA。該酶不受蛋白形式的RNase抑制劑的抑制。
應(yīng)用:
● 鑒定RNA轉(zhuǎn)錄本的5’末端;
● 富集mRNA樣品,無(wú)需使用oligo(dT)、樹脂或磁珠去除rRNA;
RNA磷酸化酶
RNA 5’ Polyphosphatase
RNA 5’ Polyphosphatase是Epicentre科學(xué)家發(fā)現(xiàn)的一個(gè)Mg2+依賴的磷酸水解酶。該酶能夠從5’-三磷酸化的RNA (如初級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄本) 依次地移除γ和β磷酸基:
5’ pppN—OH 3’ → 5’ pN—OH 3’ + 2 Pi
帶有5’-雙磷酸化末端的RNAs也可以通過(guò)RNA 5’ Polyphosphatase轉(zhuǎn)化成5’-單磷酸酶化的RNA:
5’ ppN—OH 3’ → 5’ pN—OH 3’ + Pi
RNA 5’ Polyphosphatase對(duì)含有5’帽子(例如, 5’ m7GpppN—OH 3’)或5’單磷酸化末端(5’ pN—OH 3’)的RNA沒(méi)有活性。但是NTPs和dNTPs都是該酶的底物,產(chǎn)生相應(yīng)的NMPs和dNMPs + 無(wú)機(jī)磷:
(d)NTP → (d)NMP + 2Pi
應(yīng)用:
● 將5’三磷酸化的RNA轉(zhuǎn)換成5’單磷酸化的RNA,用于使用T4 RNA Ligase的5’-RNA連接標(biāo)記反應(yīng);
● 分析RNA的5’末端結(jié)構(gòu);
● 用于制備RNA底物,后續(xù)可用于Terminator 5’-Phosphate-Dependent Exonuclease的降解反應(yīng)。
RNA聚合酶
T7 RNA Polymerase
T7 RNA聚合酶是一種高度特異性識(shí)別T7啟動(dòng)子序列的DNA依賴的5’→3’RNA聚合酶,可以催化單鏈或雙鏈DNA T7啟動(dòng)子下游NTP的摻入,合成與T7啟動(dòng)子下游的模板DNA互補(bǔ)的RNA。
應(yīng)用:RNA體外轉(zhuǎn)錄,合成mRNA。
RNA連接酶
T4 RNA Ligase
T4 RNA連接酶,是一種ATP-依賴的可以催化單鏈RNA、單鏈DNA或單核苷酸分子間或分子內(nèi)5’-P末端與3’-OH末端之間形成磷酸二酯鍵的酶。
應(yīng)用:RNA和RNA之間的連接,連接時(shí)需要5’磷酸基團(tuán)和3’羥基的存在。不僅可以進(jìn)行RNA分子間的連接,也可以進(jìn)行RNA分子(最短8個(gè)堿基)的環(huán)化連接。
RNA相關(guān)激酶
T4 Polynucleotide kinase
T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK酶)可催化ATP分子上γ位磷酸基團(tuán)向單鏈、雙鏈RNA分子和DNA分子的5’-羥基末端上轉(zhuǎn)移以及向3’-單磷酸核苷上轉(zhuǎn)移。T 多聚核苷酸激酶還具有 3’磷酸酶活性。
應(yīng)用:
● 在NGS應(yīng)用中,主要用于文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中末端修飾中的5’磷酸化修飾;
● DNA及RNA 5’末端的標(biāo)記,用于DNA測(cè)序、印跡雜交實(shí)驗(yàn)等。