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保姆級細胞凍存方法,小白進來學!
點擊次數:426 更新時間:2023-02-24

細胞凍存是細胞實驗中的一個常規步驟,是細胞保存的重要方法之一。將細胞低溫保存在-196℃液氮中,使細胞暫時脫離生長狀態而進入休眠階段,以便日后復蘇重新培養擴增。

保姆級細胞凍存方法:看似簡單的實驗,仍有一些關鍵點需要格外留意,切莫踩到“雷區",造成“實驗大翻車"。

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凍存操作前:
選擇長勢良好、存活率高,且生長密度在80%—90%的細胞進行凍存。
需對細胞進行雜質檢測:是否有雜細胞或者支原體等雜質。
這里推薦使用遠慕生物MB支原體常規法PCR檢測試劑盒,非定量檢測,常規PCR即可滿足需求,方便快捷,靈敏度高。
所用凍存試劑DMSO應為分析級,避光儲存。
凍存前一日,對需保存的細胞進行換液處理。

凍存操作
配制凍存培養基(常規含量):DMSO含量5-10%,血清含量20%左右。
用凍存培養基將離心后的細胞進行重懸。
分裝至無菌凍存管中。

梯度降溫:
4℃ 10 分鐘
-20℃ 30 分鐘
-80℃ 16~18 小時

液氮

或將裝有細胞的凍存管,置于程序降溫盒中,放入-80℃冰箱中,一天后轉移至液氮中。

液氮的液相儲存與氣相儲存

一般認為:-196℃的液氮,對于需要長期保存的細胞而言,是一比較合適的環境。因此,我們會將裝有細胞的凍存管,放入專用的方形凍存盒中,再裝進液氮罐配套的提籃提籃中,浸入液氮的液相中進行保存。

但在液相中長期儲存,容易面臨以下問題:

如果凍存管在罐內密封不嚴,則會引起液氮滲入管內,灌滿整個樣品管,造成樣品的污染。不僅如此,在取出凍存管的時候,液氮沸騰氣化使管內氣壓升高,發生炸裂,容易傷到實驗人員。

因此,有人提出,可以將細胞置于液氮的氣相中進行儲存。

液氮罐內溫度較比液相儲存高,一般在-135℃至-190℃,對于細胞儲存而言,該溫度也符合要求,但在實際操作過程中,也存在一定弊端:

與液相液氮罐相比,氣相液氮罐,在相同體積的液氮中保存時間更短,需對液氮罐內的溫度進行監控,及時補充液氮來維持罐內溫度。

所以,應根據實驗環境、實驗條件等情況,合理選擇液相儲存或是氣相儲存。在正確操作的前提下,這兩者都能達到比較好的凍存效果。

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