質粒抽提過程中有很多步驟會影響最后的產量和質量,那么如何評估質粒DNA的產量和質量呢?
目前使用分光光度法定量質粒DNA和通過瓊脂糖凝膠電泳進行質粒DNA產率和質量的分析是兩種常用的方法。
溶液中的核酸濃度可通過260 nm的吸光度方便地進行計算。A260的數值處于0.1至1.0之間時測量結果具有良好的重復性,但當A260數值小于0.1或大于1.0的時候,結果的可重復性將顯著下降。而且,3.0以上的讀值是無法使用的,它可能會潛在導致對DNA質量的低估。因此,為了獲得可靠的DNA分光光度定量結果,A260的讀值需要處于0.1至1.0之間。當檢測小量DNA時,使用瓊脂糖凝膠電泳進行的定量分析可能更為可靠。
造成較低的產率和質量的可能因素有很多。為了確定存在問題的環節,可于每一純化步驟都保留一小部分樣品,并通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析。
制備樣本
如各個實驗方案和下列表格中所示,從澄清裂解液(樣本1)、流出液(樣本2)、QC洗滌緩沖液的混合組分(樣本3)和QF/QN緩沖液洗脫產物(樣本4)中各取出部分樣品。使用1倍體積的異丙醇沉淀核酸,并使用70%的乙醇洗滌該沉淀,充分蒸干后重懸于10 µl pH8.0的TE緩沖液中。
樣本實驗方案步驟 MidiMaxiMegaGiga(極低拷貝數質粒/科斯質粒) QIAGEN-tip 100(極低拷貝數質粒/科斯質粒)QIAGEN-tip 5001240 µl120 µl120 µl75 µl600 µl750 µl2240 µl120 µl120 µl75 µl50 µl24 µl3400 µl240 µl160 µl120 µl200 µl120 µl4100 µl60 µl22 µl20 µl50 µl30 µl(制備產物占樣本量的百分比)2%0.40%0.08%0.02%1%0.20%
瓊脂糖凝膠分析
在1%的瓊脂糖凝膠中,對于各個質粒純化步驟中的對應樣品各加入2 µl進行電泳。