實驗概要
本文介紹了電泳后主要的凝膠染色方法,包括:標準考馬斯亮藍染色法、快速考馬斯亮藍染色法、凝膠銨銀染色法、凝膠中性銀染色法及凝膠銅染色法。
實驗步驟
1. 標準考馬斯亮藍染色法
1) 電泳后,將凝膠轉入一潔凈的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝膠體積的0.25%考馬斯亮藍R-250(溶解于50%甲醇和10%乙酸中);
2) 室溫下振搖溫育4h至過夜;
3) 去除染色液,收集保存可重復使用20-40次;
4) 依次在25%甲醇和7.5%乙酸中室溫振搖下脫色。靈敏度為0.1-0.5ug蛋白/每條帶。
注:使用加熱的染色液或脫色液可以縮短染色或脫色時間。將染色液或脫色液在微波爐或水浴中加熱,(大約50-60℃),染色時間可縮短至20min,脫色時間約 1-2h。
2. 快速考馬斯亮藍染色法
1) 電泳后,將凝膠轉入一潔凈的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝膠體積的0.25%考馬斯亮藍R-250(溶解于50%三lv乙酸中);
2) 室溫下振搖溫育20min;
3) 去除染色液,收集保存可重復使用多次;
4) 加入數倍體積的脫色液(25%甲醇、7%乙酸)室溫振搖下脫色。必要時可更換脫色液。靈敏度為1.0ug蛋白/每條帶。
3. 凝膠銨銀染色法
1) 電泳后,將凝膠轉入一潔凈的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝膠體積的50%乙醇和10%乙酸,振搖30min至過夜;
2) 去除50%乙醇和10%乙酸,用去離子水清洗凝膠。加入20%乙醇, 室溫振搖30min;
3) 去除20%乙醇,再加5倍體積的20%乙醇,室溫振搖30min;
4) 去除20%乙醇,將凝膠轉入通風柜內,加入5倍體積的用去離子水配制的5%戊二醛,室溫振搖30min;
5) 去除戊二醛,用去離子水清洗凝膠。加入5倍體積的20%乙醇,室溫振搖20min;
6) 去除20%乙醇,重復6兩次;
7) 去除20%乙醇,用去離子水清洗凝膠。再加入5倍體積的用去離子水,室溫溫育10min;
8) 去除去離子水,加入4倍體積新鮮配制的氨水/銀溶液,室溫振搖30min。配制100ml:加1.4ml 14.8mol/L氫氧化銨到100ml水中,再加入190ul 10mol/L氫氧化鈉;放置渦旋器上緩緩加入1ml新鮮配制的xiao酸銀溶液(0.8gxiao酸銀/ml水),直至出現沉淀物,但很快溶解。
9) 去除氨水/銀溶液,用去離子水清洗凝膠20min以上,其間更換水數次;
10) 去除水,加入5倍體積新鮮配制的0.005%檸檬酸,0.019%的甲醛。輕柔混勻,數分鐘內條帶即顯現出。當背景開始變化時,去除顯影劑,用用去離子水清洗凝膠。在10%乙酸和20%乙醇中溫育凝膠,以終止反應。靈敏度為1-10ng蛋白/每條帶。
注:操作時,應戴手套并使用潔凈的玻璃器皿,以免污染,影響反應的靈敏度。
4. 凝膠中性銀染色法
1) 電泳后,將凝膠轉入一潔凈的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝膠體積的30%乙醇和10%乙酸,振搖30min至過夜;
2) 去除乙醇/乙酸溶液,加入5倍體積的30%乙醇, 室溫振搖30min;
3) 去除乙醇,再加5倍體積的30%乙醇,室溫振搖30min;
4) 去除乙醇,加入10倍體積的去離子水,室溫振搖10min;重復用去離子水清洗兩次;
5) 去除去離子水,加入4倍體積新鮮配制的0.1%xiao酸銀溶液(用室溫下貯存于棕色瓶內的20%原液稀釋而得),室溫振搖30min;
6) 去除xiao酸銀溶液,用去離子水清洗凝膠20s;
7) 去除水,加入5倍體積的2.5%碳酸鈉和 0.02%的甲醛(pH<4.0),室溫振搖溫育,數分鐘內條帶即顯現出。當背景開始變黑時,停止溫育;
8) 在1%乙酸內清洗,停止反映。用去離子水清洗,更換數次,每次10min; 靈敏度為1-10ng蛋白/每條帶。
5. 凝膠銅染色法
凝膠銅染色法為考馬斯亮藍或銀染色法的替代染色方法。將凝膠氯化銅溶液中溫育,在Tris和SDS同時存在時可形成明顯的白色不透明的沉淀物。蛋白條仍然清晰,留下一個多肽分離模式的附染圖象。由于蛋白質未結合在凝膠上,可通過EDTA去除Cu離子而得以洗脫,因而該方法特別適合需快速定位蛋白條帶用于免疫反應,或進一步進行蛋白質化學研究。其染色模式如同考馬斯亮藍或銀染色法的凝膠,易進行拍照。
1) 電泳后,凝膠用蒸餾水短時清洗數次,每次30s,勿洗過長時間;
2) 將凝膠轉入一潔凈的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝膠體積的0.3mol/L CuCl2;
3) 室溫振搖5min,較厚的凝膠可適當延長時間。當CuCl2進入凝膠時,在不含蛋白的區域會出現白色沉淀;
4) 用蒸餾水清洗數分鐘,在黑色背景下觀察結果。靈敏度為10-100ng蛋白/每條帶(0.5mm厚的凝膠)或1ug蛋白/每條帶(1mm厚的凝膠)。
注:將凝膠在0.25mol/L EDTA、0.25mol/L Tris溶液中溫育可使銅染逆轉。